살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도
Summary
우리는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 같은 수생 생물에 사용하기위한 새로운 저산소 챔버 시스템을 소개합니다. 우리의 시스템은 간단하고 견고하며 비용 효과적이며 생체 내 및 최대 48 시간 동안 저산소증의 유도 및 지속을 허용합니다. 우리는 저산소증의 효과를 모니터하기 위해 2 가지 재현 가능한 방법을 제시한다.
Abstract
여기에서는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 같은 수생 생물에서 저산소증의 영향을 연구하기 위해 개발 한 저산소증 유도를위한 새로운 시스템을 소개합니다. 우리의 시스템은 챔버의 구성이 간단하지만 어떤 실험 솔루션에서도 특정 산소 농도와 온도를 유도하고 유지할 수 있습니다. 제시된 시스템은 매우 비용 효율적이지만 기능이 뛰어나 생체 내 및 48 시간 이하의 다양한 기간 동안 직접 실험 을 위한 저산소증의 유도 및 지속을 허용합니다.
저산소증의 영향을 모니터하고 연구하기 위해 우리는 전체 배아 또는 특정 조직에서 저산소 – 유도 성 인자 1 알파 (HIF-1α)의 수준 측정과 5-에 티닐 -2 '에 의한 망막 줄기 세포 증식의 측정, 데 옥시 우리 딘 (EdU)이 DNA에 통합되었다. HIF-1α 수준은 전체 배아 또는 조직에서 일반적인 저산소증 마커로 작용할 수있다선택의 여지가, 여기 배아 망막. 배아 망막의 증식하는 세포 내로의 EdU 결합은 저산소증 유도의 특정 산출물이다. 따라서 우리는 저산소 배아 망막 전구 세포가 개구리와 제브라 피쉬 배아의 5 % 산소 하에서 배양 1 시간 이내에 증식을 감소 시킨다는 것을 보여 주었다.
마스터 한 후에는 작은 수생 모델 생물체, 직접 생체 내 실험, 임의의 주어진 시간 및 정상, 저산소 또는 고 산소 산소 농도 또는 임의의 다른 주어진 가스 혼합물 하에서 사용하기 위해 본 장치를 사용할 수있다.
Introduction
저산소증 연구는 수많은 응용 분야를 가지고 있습니다. 여기에는 저산소증 1 과 급성 고산병 2에 의해 특징 지어지는 병적 상태에 대한 조사와 병적 치료법 개발이 포함됩니다. 저산소증 스트레스는 산소를 필요로하는 모든 유기체에서 중요한 대사 변화를 일으 킵니다. 저산소증 스트레스는 자궁 내 성장 제한을 포함한 여러 가지 인간 질병의 태아 성장 및 발달 및 병인에 영향을 미친다. 저산소증은 출생 체중 감소, 태아 및 신생아 사망률을 감소시킬뿐만 아니라 심혈관 질환, 2 형 당뇨병, 비만 및 고혈압과 같은 성인 생활에서 많은 합병증을 유발할 수 있습니다. 저산소증 스트레스는 또한 종양 조직이 혈액 공급을 초과하여 성장하는 고형 종양 발생시 종종 관찰됩니다. 따라서 생체 내에서 저산소증의 효과를 직접적으로 연구 할 수 있어야합니다. yonic 개발.
발달 중 저산소증의 영향을 연구하기 위해 사용 된 가장 잘 알려진 방법 중 하나는 저칼륨 챔버에서 생균 배양 또는 배양에서 염화 코발트를 사용하는 것입니다. 염화 코발트는 저산소증 유도 성 인자 -1 알파 (HIF-1α)의 proteosomal degradation을 방지하여 안정화시키는 역할을하기 때문에 인위적으로 정상 산소 농도에서 저산소 반응을 유도합니다 5 , 6 , 7 . 그러나, 편리한 방법 8 일 때, 코발트 염화물뿐만 아니라 다른 유사한 화학 저산소증 모방 체의 사용은 세포 및 조직, 예를 들면 , 아폽토시스 9 에 대해 비특이적 인 해로운 효과를 가질 수있다. 따라서 저산소 챔버는 정상적인 발달 과정을 통해 살아있는 생물체에서 "자연 hypoxia"를 유도하는 더 좋은 방법입니다.
ntent "> 우리는 수생 동물 배아에서 저산소증 유도 시스템 개발에 중점을 두었습니다. 개구리와 제브라 피시 모두 다양한 생물학적 과정의 연구를위한 유익한 척추 모델 생물뿐만 아니라 다양한 인간 질병의 모델이되었습니다. 개구리와 제브라 피쉬 태아 모체 보상의 합병증을 제거하고 외부 적으로 발달하며 신속한 개발 과정을 통해 환경 요인을 조작하고 장기 형성의 표현형 변화를 실시간으로 관찰 할 수 있습니다. 또한 주요 신호 전달 경로의 많은 구성 요소는 이 모델 생물체는 많은 문헌에 의해 상세하게 특성화되어 있습니다. 개구리와 제브라 피쉬 배아를 사용하여 척추 동물의 발달에 저산소증의 영향을 연구 할 때의 주요 이점은 산소가 배아에 빠르게 침투하기 때문에 모든 과정을 직접 모니터링 할 수 있다는 것입니다. 따라서 개구리와 제브라 피쉬에서는 다른 모델 생물과 달리마우스 배아에서 특정 산소 농도의 영향은 기능 조직계의 존재 또는 부재를 고려하지 않고 관심있는 조직에서 연구 될 수있다.저산소 배양을위한 상업적으로 이용 가능한 대부분의 설치는 비교적 크고 상응하는 높은 운전 비용을 갖는 단점이있다. 초기 저비용 및 가스 소비가 높다는 점을 제외하고 일반적인 저산소 챔버의 평형 유지 및 유지는보다 큰 크기 및 / 또는 생물학적 호흡으로 인해 자연적으로 이러한 챔버에서 발생하는 가스 구배에 대해 일정한 저산소 대기를 유지해야합니다. 이것은 가스 팬과 냉각 장치의 사용을 필요로하며, 이는 필요한 추가 장치의 양을 증가시키고 연구자의 손재주를 방해하며 실험 절차의 단순성을 감소시킨다. 대조적으로, 우리가 여기에 제시 한 설정은 비교적 견고하지만 매우 비용 효율적이고 작고 설치하기 쉽고 f천 가스 평형, 안정적인 저산소 대기 및 챔버 내의 재료 및 용액의 간단한 교환. 우리 시스템은 관심있는 수생 모델 유기체와 함께 사용할 수 있습니다.
우리는 편리하게 작은 저산소 챔버를 만들었고, 따라서 특정 온도에서 실험 절차를 쉽게 허용하는 일반적인 실험실 배양기 안에 배치 할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 저산소 배양기에 대한 우리 시스템의 장점은 배지의 산소 농도뿐만 아니라 온도의 편리한 조절을 제공하여 크기가 작고 비용 효율성이 우수하다는 것입니다. 따라서 대부분의 연구실에서 사용할 수있는 일반 실험실 소모품을 사용하여 설정을 구성 할 수 있으며 값 비싼 재료가 필요하지 않습니다. 또한 시판되는 저산소 배양기와는 달리 열을 발생시키지 않으며 인큐베이터에 넣은 실내 온도보다 낮은 온도에서 사용할 수 있습니다. 라발달 및 신진 대사 속도가 강하게 온도 의존적 인 개구리와 물고기와 같은 냉혈 생물과의 작업에 특히 중요합니다.
매우 비용 효율적이고 쉽게 구축 할 수 있기 때문에 GE의 가스 보온 챔버는 다양한 저산소 또는 고 산소 상태를 구축하는 데 매우 유용 할뿐만 아니라 방대한 수의 실험 조건에 대해 다양한 매체 및 솔루션을 빠르고 쉽게 관리 할 수 있습니다. 또한 일반적으로 사용되는 접시 또는 실험실 탱크 10 , 11 , 12 대신 24-well plate를 사용하여 여러 가지 돌연변이 조건을 한 번에 관찰하고 실험적으로 처리 할 수 있습니다.
저산소증의 정확한 유도를 조절하기 위해 우리는 Western blot detection에 의해 HIF-1α 단백질의 수준을 모니터링했습니다. 또한, 배양 전후의 증식하는 세포의 수저산소실의 n은 저산소증이 조직에 유도되었는지를 결정하는데 사용될 수있다. 이 방법은 저산소증의 유도시 배아 망막 줄기 세포 틈새의 증식이 감소 함을 보여주는 이전에 발표 된 결과 13을 기반으로합니다. 따라서 우리는 배아 배지에 5- ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)을 첨가하고 새로 증식하는 세포의 DNA 로의 결합을 측정함으로써 망막 줄기 세포 증식의 수준을 모니터링했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 개구리 및 제브라 피쉬 배아와 함께 사용하도록 조정 된 저산소증을 유도하는 쉽고도 강력한 새 방법을 제시했지만 다른 수생 생물에도 적합 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 단순성과 비용 효율성입니다. 그럼에도 불구하고이 방법으로 얻은 결과는 매우 강력합니다. 우리는 hypoxia가 전체 조직뿐만 아니라 특정 조직 (여기서는 망막)에서 챔버 내에서 효과적으로 유도 될 수 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 웰컴 트러스트 SIA 100329 / Z / 12 / Z에서 WAH 로의 지원과 HK에 수여 된 DFG Fellowship KH 376 / 1-1에서 지원되었습니다.
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
