Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish
Summary
Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l'induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l'efficacia dell'ipossia.
Abstract
Qui introduciamo un nuovo sistema per l'induzione di ipossia, che abbiamo sviluppato per studiare gli effetti dell'ipossia negli organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema comprende una camera con una semplice configurazione che è tuttavia robusta per indurre e mantenere una specifica concentrazione e temperatura di ossigeno in qualsiasi soluzione sperimentale di scelta. Il sistema presentato è molto efficace in termini di costi, ma altamente funzionale, permette l'induzione e il sostegno di ipossia per esperimenti diretti in vivo e per vari periodi di tempo fino a 48 ore.
Per monitorare e studiare gli effetti dell'ipossia, abbiamo impiegato due metodi: la misura dei livelli di fattore 1alpha (HIF-1α) inducibile all'ipossia in embrioni interi o nei tessuti specifici e la determinazione della proliferazione delle cellule staminali retiniche mediante 5-etinil-2'- Deoxyuridine (EdU) nel DNA. I livelli HIF-1α possono servire da indicatore di ipossia generale in tutto l'embrione o il tessutoDi scelta, qui retina embrionale. L'incorporazione di EdU nelle cellule proliferanti della retina embrionale è un'uscita specifica dell'induzione di ipossia. Così abbiamo dimostrato che i progenitori ematici retinici ipossici diminuiscono la proliferazione entro 1 ora di incubazione sotto il 5% di ossigeno di entrambi gli embrioni di rana e zebrafish.
Una volta acquisita, la nostra configurazione può essere impiegata per l'utilizzo con piccoli organismi del modello acquatico, per esperimenti diretti in vivo , in un determinato periodo di tempo e in concentrazione normale o ipossidica o iperossica o sotto qualsiasi altra miscela di gas.
Introduction
La ricerca di ipossia ha numerose applicazioni. Questi includono indagare la patogenesi e sviluppare trattamenti per le condizioni mediche caratterizzate da ipossia 1 e malattia acuta di alta altitudine 2 . Lo stress ipossico provoca importanti cambiamenti metabolici in tutti gli organismi che richiedono ossigeno. Lo stress ipossico influenza anche la crescita fetale e lo sviluppo e la patogenesi di diverse malattie umane, inclusa la restrizione intrauterina della crescita 3 . Lo stress ipossico non può solo portare a ridurre il peso alla nascita, la mortalità fetale e neonatale, ma può anche provocare molte complicazioni nella vita adulta, come la malattia cardiovascolare, il diabete di tipo 2, l'obesità e l'ipertensione 4 . Lo stress ipossico è spesso osservato durante lo sviluppo del tumore solido, quando il tessuto tumorale supera la sua offerta di sangue. È quindi fondamentale poter studiare gli effetti dell'ipossia in vivo e direttamente durante l'embr Lo sviluppo yonic.
Tra i metodi più noti che sono stati utilizzati per studiare gli effetti dell'ipossia durante lo sviluppo è l'impiego di cloruro di cobalto nel mezzo di crescita o l'incubazione dell'organismo in una camera ipossica. La cloruro di cobalto induce artificialmente una reazione ipossidica alla normale concentrazione di ossigeno, a causa del suo ruolo nella stabilizzazione di alfa (HIF-1α) di fattore-1 indotta da ipossia, impedendo il degrado proteosomico 5 , 6 , 7 . Tuttavia, essendo un metodo conveniente 8 , l'uso di cloruro di cobalto e altri simili mimetici di ipossia chimica possono avere effetti deleteri non specifici sulle cellule e sui tessuti, ad esempio l' apoptosi 9 . Di conseguenza, le camere ipossiche sono un metodo migliore per l'induzione di "ipossia naturale" negli organismi viventi attraverso il corso di uno sviluppo normale.
Ntent "> Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un sistema per l'induzione di ipossia negli embrioni animali acquatici, sia le rane che gli zebrafish che sono diventati degli organismi modello vertebrati informativi per studi di numerosi processi biologici, nonché modelli per varie malattie umane. Sviluppare ulteriormente, eliminando la complicazione della compensazione materna Inoltre, un rapido sviluppo dello sviluppo consente di manipolare i fattori ambientali e di osservare i cambiamenti fenotipici nella formazione degli organi in tempo reale. Inoltre, molti componenti dei principali percorsi di trasduzione del segnale sono altamente conservati Questi organismi di modello sono stati caratterizzati in dettaglio da un ampio volume di letteratura. Il principale vantaggio nell'uso delle rane e degli embrioni di zebrafish per studiare gli effetti dell'ipossia sullo sviluppo del vertebrato è che tutti i processi possono essere monitorati direttamente, in quanto l'ossigeno penetra rapidamente negli embrioni. Così, in rane e zebrafish, come in contrasto con altri organismi di modello comeEmbrioni di topi, l'influenza di una specifica concentrazione di ossigeno può essere studiata nel tessuto di interesse, senza prendere in considerazione la presenza o la mancanza di vascolarizzazione funzionale.La maggior parte delle configurazioni commercialmente disponibili per l'incubazione ipossica presenta lo svantaggio di essere comparabilmente grandi e avendo così elevati costi di funzionamento. Oltre al loro elevato costo iniziale e al consumo di gas, l'equilibratura e la manutenzione di camere comuni di ipossia richiedono l'assunzione di un'atmosfera ipossica costante contro il gradiente del gas che si verifica naturalmente in queste camere a causa della loro dimensione e / o respiratorio dell'organismo. Ciò richiede l'impiego di ventilatori a gas e di un sistema di raffreddamento, che aumenta la quantità di apparecchiature necessarie aggiuntive, ostacola la destrezza del ricercatore e in generale diminuisce la semplicità della procedura sperimentale. Al contrario, l'installazione che presentiamo qui è comparabilmente robusta ma molto conveniente, piccola, facile da stabilire e permette fL'equilibratura del gas, l'atmosfera ipossica stabile e lo scambio semplice di materiali e soluzioni all'interno della camera. Il nostro sistema può essere utilizzato per l'utilizzo con qualsiasi organismo di interesse acquatico.
Abbiamo costruito una camera ipossica che è convenientemente piccola e quindi può essere collocata all'interno di un incubatore di laboratorio comune, che consente facilmente le procedure sperimentali a qualsiasi temperatura specifica. Fornire un comodo controllo della temperatura e la concentrazione di ossigeno nel mezzo, il vantaggio del nostro sistema contro gli incubatori di ipossia commercialmente disponibili risiede nella sua ridotta dimensione e nell'efficienza dei costi. Quindi, la nostra configurazione può essere creata usando le forniture di laboratorio disponibili per la maggior parte dei laboratori di ricerca e non richiedono materiali costosi. Inoltre, la nostra configurazione non genera calore, a differenza degli incubatori di ipossia commercialmente disponibili e consente l'utilizzo a temperature inferiori alla temperatura ambiente in un incubatore. La laSt è particolarmente importante per il lavoro con organismi sangue freddi come rane e pesci dove i tassi di sviluppo e metabolismo sono fortemente dipendenti dalla temperatura.
Essendo molto conveniente e facilmente costruito, la nostra camera di incubazione del gas è tuttavia molto versatile nella determinazione di diverse condizioni ipossiche o iperossiche, oltre a consentire una gestione rapida e facile di diversi supporti e soluzioni per un vasto numero di condizioni sperimentali. Inoltre, impiegando una piastra a 24 pozzetti invece di piatti comunemente usati o serbatoi di laboratorio 10 , 11 , 12 , il nostro sistema consente di osservare e sperimentare contemporaneamente diverse condizioni mutanti.
Per controllare la corretta induzione dell'ipossia, abbiamo monitorato i livelli della proteina HIF-1α mediante la rilevazione Western blot. Inoltre, il numero di cellule proliferanti prima e dopo l'incubazioneN nella camera ipossica può essere utilizzato per determinare se l'ipossia è stata indotta nel tessuto. Questo metodo si basa sui nostri risultati pubblicati in precedenza 13 , mostrando che la proliferazione nella nicchia delle cellule staminali del retino embrionale diminuisce dopo l'induzione dell'ipossia. Così abbiamo monitorato il livello della proliferazione delle cellule staminali retiniche aggiungendo l'5-etinil-2'-deoxyuridine (EdU) al mezzo embrionale e misurando la sua incorporazione nel DNA delle cellule appena proliferanti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui abbiamo presentato un nuovo metodo semplice ma robusto per indurre l'ipossia che è regolato per l'uso con embrioni di rana e zebrafish, ma può anche essere adatto ad altri organismi acquatici. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella semplicità e nell'efficienza dei costi. Tuttavia, i risultati ottenuti con questo metodo sono molto robusti. Abbiamo dimostrato che l'ipossia può essere efficacemente indotta nella camera sia in embrioni interi che in tessuti specifici – qui, retinas. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno da Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e dalla borsa DFG KH 376 / 1-1 assegnata a HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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