אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי
Summary
אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של היפוקסיה.
Abstract
כאן, אנו מציגים מערכת חדשנית לאינדוקציה היפוקסיה, אשר פיתחנו כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה באורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו כוללת חדר שמציעה התקנה פשוטה, כי הוא חזק בכל זאת כדי לשמר ולשמור על ריכוז חמצן מסוים הטמפרטורה בכל פתרון ניסיוני של בחירה. המערכת המוצגת היא מאוד חסכונית אבל פונקציונלי מאוד, זה מאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה עבור ניסויים ישיר vivo ו לתקופות זמן שונות עד 48 שעות.
כדי לבחון ולחקור את ההשפעות של היפוקסיה, השתמשנו בשתי שיטות – מדידת רמות של גורם היפוקסיה-גורם להופעת אלפא (HIF-1α) בעוברים שלמים או רקמות ספציפיות וקביעת התאמת תאי גזע ברשתית באמצעות 5-ethynyl-2'- Deoxyuridine (Edu) שילוב לתוך ה- DNA. רמות HIF-1α יכולות לשמש סמן היפוקסיה כללי בכל העובר או הרקמותשל בחירה, כאן רשתית עובריים. שילוב EDU לתוך תאים מתרבים של הרשתית עובריים הוא פלט מסוים של אינדוקציה היפוקסיה. לכן, הראינו כי אבות הרשתית היפוקסי ירידה התפשטות תוך 1 שעה של הדגירה תחת 5% חמצן של עוברי הצפרדע וגם דג הזברה.
לאחר השתלבותנו, ניתן להשתמש בהתקנה שלנו לשימוש עם אורגניזמים קטנים של מודלים ימיים, בניסויים ישירים של vivo , בכל תקופת זמן נתונה ובתת-חמצן נורמלי, היפוקסי או היפר-חמצני או תחת כל תערובת גז נתונה אחרת.
Introduction
מחקר Hypoxia יש יישומים רבים. אלה כוללים לחקור את הפתוגנזה ולפתח טיפולים למצבים רפואיים המאופיינים בהיפוקסיה 1 ומחלת גבהים גבוהה 2 . מתח היפוקסי גורם לשינויים מטבוליים משמעותיים בכל האורגניזמים הדורשים חמצן. הלחץ ההיפוקסי משפיע גם על התפתחות העובר ועל התפתחות המחלה ועל מספר מחלות אנושיות, כולל הגבלת צמיחה תוך רחמית. מתח היפוסי אינו יכול רק לגרום לירידה במשקל הלידה, לתמותה בעובר ולילוד, אלא גם לגרום לסיבוכים רבים בחיים הבוגרים, כגון מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2, השמנת יתר ויתר לחץ דם 4 . לחץ היפוקסי הוא גם נצפה לעתים קרובות במהלך התפתחות הגידול מוצק, כאשר רקמת הגידול מתגבר אספקת הדם שלה. לכן חיוני כדי להיות מסוגל ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה in vivo ו ישירות במהלך embr יונית פיתוח.
בין השיטות הידועות ביותר אשר הועסקו במחקר ההשפעות של היפוקסיה במהלך הפיתוח הוא השימוש של כלור קובלט במדיום הצמיחה או הדגירה של האורגניזם בחדר היפוקסי. קובלט כלוריד גורם באופן מלאכותי תגובה היפוקסית תחת ריכוז החמצן הרגיל, בשל תפקידה בייצוב של גורם היפוקסיה גורם 1 אלפא (HIF-1α) על ידי מניעת השפלה פרוטאוזומלית שלה 5 , 6 , 7 . עם זאת, להיות שיטה נוחה 8 , את השימוש של כלוריד קובלט, כמו גם אחרים דומים היפוקסיה כימית mimetics יכול להיות השפעה מזיקה unspecific על תאים ורקמות, למשל , אפופטוזיס 9 . לכן, תאים hypoxic הם שיטה טובה יותר עבור אינדוקציה של "היפוקסיה טבעית" באורגניזמים חיים במהלך ההתפתחות הרגילה.
"אנחנו מתמקדים בפיתוח מערכת לאינדוקציה של היפוקסיה בעוברי בעלי חיים ימיים, הן צפרדעים והן דג הזברה הפכו כעת לאורגניזמים של מודל חוליות אינפורמטיבי למחקרים על תהליכים ביולוגיים רבים, כמו גם מודלים למחלות שונות של בני אדם.צפרדעים ועופות דג הזברה מתפתחת חיצונית ומבטלת את הסיבוך של הפיצוי האימהי.כמובן, מסלול מהיר של פיתוח מאפשר לתמרן גורמים סביבתיים ולבחון את השינויים פנוטיפי של היווצרות איברים בזמן אמת.בנוסף, מרכיבים רבים של מסלולי התמרת האות העיקריים נשמרים מאוד ב אלה אורגניזמים מודל מאופיינים בפירוט על ידי גוף גדול של הספרות.היתרון העיקרי באמצעות צפרדעים ועובדי דג הזברה ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה על התפתחות החולייתנים היא שכל התהליכים ניתן לפקח ישירות, שכן החמצן חודר במהירות העוברים. לפיכך, צפרדעים דג הזברה, בניגוד אורגניזמים מודל אחרים כגוןעכברים העכבר, ההשפעה של ריכוז חמצן מסוים ניתן ללמוד רקמות של עניין, מבלי לקחת בחשבון את נוכחות או חוסר של כלי הדם תפקודית.רוב setups זמין מסחרית עבור הדגירה hypoxic יש את החיסרון להיות גדול יחסית ויש עלויות ריצה גבוהות בהתאמה. מלבד העלות הראשונית הגבוהה שלהם וצריכת הגז, שיווי משקל ותחזוקה של תאי היפוקסיה נפוצים מחייבת שמירה על אווירה היפוקסית מתמדת כנגד התדרדרות הגז המתרחשת באופן טבעי בתאי אלה בגלל הגודל הגדול יותר ו / או הנשימה של האורגניזם. זה דורש תעסוקה של מאווררי גז ומערכת קירור, אשר מגדיל את כמות הציוד הדרוש נוסף, מעכב את המיומנות של החוקר הכוללת מקטין את הפשטות של הליך ניסיוני. לעומת זאת, את ההתקנה אנו מציגים כאן הוא חזק יחסית, אבל מאוד חסכונית, קטן, קל להקים ומאפשר fאסט גזיזת גז, אווירה hypoxic יציב חילופי פשוט של חומרים ופתרונות בתוך החדר. המערכת שלנו יכול להיות מועסק לשימוש עם כל אורגניזם מודל ימיים של עניין.
בנינו תא hypoxic כי הוא קטן בנוחות ולכן ניתן להציב בתוך חממה משותפת, אשר בקלות מאפשר הליכים ניסיוניים בכל טמפרטורה מסוימת. מתן שליטה נוחה בטמפרטורה כמו גם ריכוז החמצן במדיום, היתרון של המערכת שלנו נגד חממות היפוקסיה זמין מסחרית טמון בגודלו הקטן ויעילות העלות. לפיכך, ההתקנה שלנו ניתן להקים באמצעות ציוד מעבדה כללית זמין עבור רוב המעבדות מחקר אינו דורש שום חומרים יקרים. בנוסף, ההתקנה שלנו אינה מייצרת חום, בניגוד החסרונות זמינים מסחרית היפוקסיה, ומאפשר להשתמש בטמפרטורות נמוכות יותר בטמפרטורת החדר להיות ממוקם באינקובטור. להSt הוא קריטי במיוחד עבור העבודה עם אורגניזמים קר דם כגון צפרדעים ודגים שבו שיעורי התפתחותיים מטבוליים תלויים מאוד בטמפרטורה.
להיות מאוד חסכונית ובנו בקלות, החדר הדגירה שלנו הוא עדיין תכליתי מאוד בהקמת שונים hypoxic או hyperoxic התנאים, כמו גם המאפשר מהיר וקל הממשל של מדיה שונים ופתרונות עבור מספר עצום של תנאי הניסוי. בנוסף, באמצעות צלחת 24-היטב במקום מנות נפוץ או טנקים מעבדה 10 , 11 , 12 , המערכת שלנו מאפשרת תצפית וטיפול ניסיוני של כמה תנאים מוטציה בבת אחת.
כדי לשלוט על אינדוקציה נכונה של היפוקסיה, יש לנו פיקוח על רמות של חלבון HIF-1α על ידי זיהוי כתם המערבי. בנוסף, מספר תאים מתרבים לפני ואחרי incubatioN בחדר היפוקסי ניתן להשתמש כדי לקבוע אם היפוקסיה כבר המושרה ברקמה. שיטה זו מבוססת על התוצאות שפורסמו בעבר 13 שלנו , מראה כי התפשטות עובריים בגזע נישה בתאי ניוון פוחתת על אינדוקציה של היפוקסיה. לכן, יש לנו פיקוח על רמת התפשטות תא גזע הרשתית על ידי הוספת 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) למדיום העובר ומדידת שילובו לתוך ה- DNA של תאים חדשים התפשטות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן הצגנו שיטה חדשה אך קלה וחדשה לגרום היפוקסיה המותאמת לשימוש עם עופות צפרדע דג הזברה אבל יכול גם להיות מתאים לאורגניזמים מימיים אחרים. היתרון העיקרי של שיטה זו טמון בפשטות שלה ואת עלות העלות. עם זאת, התוצאות שהושגו בשיטה זו הן חזקות מאוד. הראינו כי היפוקסיה ניתן המו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תמיכה מ Wellcome Trust SIA פרס 100329 / Z / 12 / Z ל WAH ואת מלגת DFG KH 376 / 1-1 הוענק HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
