Summary
Introducimos un nuevo sistema de cámara hipóxico para su uso con organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema es simple, robusto, rentable y permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia in vivo y hasta 48 horas. Presentamos 2 métodos reproducibles para monitorear la efectividad de la hipoxia.
Abstract
Aquí, introducimos un nuevo sistema para la inducción de hipoxia, que desarrollamos para estudiar los efectos de la hipoxia en organismos acuáticos como los embriones de sapo y pez cebra. Nuestro sistema comprende una cámara con una instalación sencilla pero que es, sin embargo, robusta para inducir y mantener una concentración específica de oxígeno y temperatura en cualquier solución experimental de elección. El sistema presentado es muy rentable pero altamente funcional, permite la inducción y mantenimiento de la hipoxia para experimentos directos in vivo y durante varios periodos de tiempo de hasta 48 h.
Para monitorear y estudiar los efectos de la hipoxia, se han empleado dos métodos - la medición de los niveles de hipoxia inducible factor 1alfa (HIF-1α) en embriones enteros o tejidos específicos y la determinación de la proliferación de células madre retinianas por 5-etinil-2'- Desoxiuridina (EdU) en el ADN. Los niveles de HIF-1 alpha pueden servir como un marcador general de hipoxia en todo el embrión o tejidoDe elección, aquí la retina embrionaria. La incorporación de EDU en las células proliferantes de la retina embrionaria es un resultado específico de la inducción de hipoxia. Por lo tanto, hemos demostrado que hypoxic progenitores de la retina embrionaria disminuir la proliferación dentro de 1 h de incubación en el 5% de oxígeno de la rana y el pez cebra embriones.
Una vez dominado, nuestro sistema se puede emplear para el uso con micro organismos acuáticos pequeños, para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo concentración de oxígeno normal, hipóxico o hiperóxico o bajo cualquier otra mezcla de gases dada.
Introduction
La investigación de la hipóxia tiene numerosas aplicaciones. Estos incluyen la investigación de la patogénesis y el desarrollo de tratamientos para condiciones médicas que se caracterizan por la hipoxia 1 y la enfermedad de alta altitud aguda 2 . El estrés hipóxico causa importantes cambios metabólicos en todos los organismos que requieren oxígeno. Estrés hipóxico también influye en el crecimiento fetal y el desarrollo y la patogénesis de varias enfermedades humanas, incluida la restricción de crecimiento intrauterino [ 3] . El estrés hipóxico puede no sólo conducir a la reducción del peso al nacer, la mortalidad fetal y neonatal, sino que también puede dar lugar a muchas complicaciones en la vida adulta, como las enfermedades cardiovasculares, la diabetes tipo 2, la obesidad y la hipertensión 4 . El estrés hipóxico también se observa a menudo durante el desarrollo del tumor sólido, cuando el tejido tumoral supera su suministro de sangre. Por lo tanto, es crucial para poder estudiar los efectos de la hipoxia in vivo y directamente durante el embrión Desarrollo yónico.
Entre los métodos más conocidos que se han empleado para estudiar los efectos de la hipoxia durante el desarrollo es el uso de cloruro de cobalto en el medio de crecimiento o la incubación del organismo en una cámara hipóxica. El cloruro de cobalto induce artificialmente una respuesta hipóxica bajo concentración normal de oxígeno, debido a su papel en la estabilización del factor-1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α) al prevenir su degradación proteosómica 5 , 6 , 7 . Sin embargo, siendo un método conveniente 8 , el uso de cloruro de cobalto así como otros similares miméticos de hipoxia química pueden tener un efecto deletéreo inespecífico en células y tejidos, por ejemplo , apoptosis 9 . Por lo tanto, las cámaras hipóxicas son un mejor método para la inducción de "hipoxia natural" en organismos vivos a través del desarrollo normal.
Ntent "> Nos hemos centrado en el desarrollo de un sistema para la inducción de la hipoxia en los embriones de animales acuáticos.Las ranas y el pez cebra se han convertido en organismos informativos modelo de vertebrados para los estudios de numerosos procesos biológicos, así como los modelos de diversas enfermedades humanas. Además, un desarrollo rápido permite manipular factores ambientales y observar los cambios fenotípicos en la formación de órganos en tiempo real. Además, muchos componentes de las principales vías de transducción de señales están altamente conservados en Estos organismos modelo y se han caracterizado en detalle por un gran cuerpo de la literatura.La principal ventaja en el uso de ranas y embriones de pez cebra para estudiar los efectos de la hipoxia en el desarrollo de vertebrados es que todos los procesos pueden ser controlados directamente, ya que el oxígeno penetra rápidamente en los embriones. Así, en las ranas y el pez cebra, como en contraste con otros organismos modelo tales comoEmbriones de ratón, se puede estudiar la influencia de una concentración específica de oxígeno en el tejido de interés, sin tener en cuenta la presencia o ausencia de vasculatura funcional.La mayoría de las configuraciones comercialmente disponibles para la incubación hipóxica tienen la desventaja de ser comparativamente grandes y tener costes de funcionamiento correspondientemente altos. Aparte de su alto costo inicial y consumo de gas, el equilibrio y el mantenimiento de las cámaras comunes de hipoxia requiere el mantenimiento de una atmósfera hipóxica constante contra el gradiente de gas que ocurre naturalmente en estas cámaras debido a su mayor tamaño y / o respiración del organismo. Esto requiere el empleo de ventiladores de gas y un sistema de refrigeración, lo que aumenta la cantidad de equipo adicional necesario, impide la destreza del investigador y en general disminuye la simplicidad del procedimiento experimental. En contraste, la configuración que presentamos aquí es comparativamente robusta pero muy rentable, pequeña, fácil de establecer y permite fEquilibrio de gases, una atmósfera hipóxica estable y un simple intercambio de materiales y soluciones dentro de la cámara. Nuestro sistema puede emplearse para su uso con cualquier organismo modelo acuático de interés.
Hemos construido una cámara hipóxica que es convenientemente pequeña y por lo tanto se puede colocar dentro de una incubadora de laboratorio común, lo que permite fácilmente procedimientos experimentales a cualquier temperatura específica. Proporcionando un control conveniente de la temperatura así como la concentración de oxígeno en el medio, la ventaja de nuestro sistema frente a las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles reside en su pequeño tamaño y rentabilidad. Por lo tanto, nuestra configuración puede establecerse utilizando suministros generales de laboratorio disponibles para la mayoría de los laboratorios de investigación y no requiere materiales caros. Además, nuestra instalación no genera calor, a diferencia de las incubadoras de hipoxia comercialmente disponibles, y permite su uso a temperaturas inferiores a la temperatura ambiente que se colocan en una incubadora. El laSt es especialmente crítico para el trabajo con organismos de sangre fría tales como ranas y peces donde las tasas de desarrollo y metabólicas son fuertemente dependientes de la temperatura.
Al ser muy rentable y de fácil construcción, nuestra cámara de incubación de gas es sin embargo muy versátil en el establecimiento de diversas condiciones hipóxicas o hiperóxicas, así como permite la administración rápida y fácil de diferentes medios y soluciones para un gran número de condiciones experimentales. Además, empleando una placa de 24 pocillos en lugar de platos de uso común o tanques de laboratorio 10 , 11 , 12 , nuestro sistema permite la observación y el tratamiento experimental de varias condiciones mutantes a la vez.
Para controlar la correcta inducción de la hipoxia, hemos monitorizado los niveles de la proteína HIF-1 α por Western blot detección. Además, el número de células que proliferan antes y después de la incubaciónN en la cámara hipóxica se puede utilizar para determinar si se ha inducido hipoxia en el tejido. Este método se basa en nuestros resultados previamente publicados 13 , que muestran que la proliferación en el nicho embrionario de células madre retina disminuye a la inducción de la hipoxia. Por lo tanto, hemos monitoreado el nivel de proliferación de células madre retinianas añadiendo 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) al medio embrionario y midiendo su incorporación en el ADN de células que proliferan recientemente.
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Protocol
Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal de la Universidad de Cambridge.
1. Mantenimiento de animales
- Embriones de rana
NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales.- Preparar solución de solución de Barth (MBS) modificada 0,1x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 μM, NaHCO3 24 μM, HEPES 100 μM, MgSO4 8,2 μM, Ca (NO3) 2 3,3 μM y CaCl2 4,1 μM, pH 7,6 .
- Obtener embriones de Xenopus laevis mediante fertilización in vitro.
- Inducir la ovulación en ranas adultas africanas ( Xenopus laevis) por inyección con gonadotropina sérica de yegua preñada una semana (60 UI) y 12 h (500 UI) antes de la puesta.
- Recoger los ovocitos y fertilizarlos in vitro con testículo masculino homogeneizado.
- RaiSe embriones en 0.1x MBS a 16-18 ° C. Etapa de los embriones de acuerdo con la tabla Normal de Xenopus laevis [ 14] . Tenga cuidado en la selección de embriones enteros y vivos para el experimento.
- Embriones de pez cebra
NOTA: Los embriones pueden ser criados y mantenidos de acuerdo con las instalaciones del animal y del laboratorio. Aquí se describe un ejemplo del mantenimiento de los animales.- Preparar medio de embrión: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl _ { 2 } 0,33 mM, MgSO _ { 4 } 0,33 mM y azul de metileno al 0,00001%.
- Mantener y cultivar la cepa WT AB Danio rerio a 26.5 ° C.
- Recoger los embriones en la mañana de la fertilización, levantar hasta 4 d post fertilización (dpf) a 28 ° C en medio embrionario preparado como se describe anteriormente, seleccionar y poner en escena como se describe anteriormente [ 15] .
2. Inducción de la hipoxia in vivo
- Utilice un tanque acuático de cría ( Figura 1A ) que se utiliza normalmente en la instalación de peces para la construcción de cámara hipóxica. Este tanque debe encajar en una placa de 24 pocillos.
- Preparar una placa de 24 pocillos de fondo de malla como se muestra en la Figura 1 . Quitar la parte inferior de plástico de la placa de 24 pocillos ( figura 1B ), por ejemplo , utilizando una fresadora para este fin.
- Llenar el espacio entre el plástico de los pozos y las paredes de la placa con resina epoxi. Conecte un filtro de nylon ( Figura 1C ) con un diámetro de malla de 0,1-0,2 mm al plástico recubierto de resina y deje que la placa esté completamente seca.
- Una vez seco, taladre tres o cuatro túneles ( Figura 1D ) de 10 mm de longitud y 5 mm de diámetro en las paredes de la placa recubierta de resina y malla. Sujete varillas de plástico o de Teflón( Figura 1E ) de diámetro apropiado y 30 mm de longitud a los túneles y colocar la placa en el tanque de elección.
- Coloque la placa de 24 pocillos de fondo de malla en el tanque acuático de elección. Utilizando un tubo de silicona ( Figura 1F ), conecte un tanque de gas ( Figura 1G ) con la mezcla de O 2 / N 2 deseada u otra mezcla de gases de elección a una válvula distribuidora ( Figura 1H ) usando un regulador de gas apropiado (I) (BOC 200 bar). En este caso, utilice tanques de gas que contengan una mezcla de 5% de oxígeno y 95% de N 2 en los experimentos de hipoxia presentados aquí.
- Ajuste el caudal de oxígeno en el medio de la cámara a 0,0017-0,0019 metros cúbicos por segundo. Bajo este caudal de gas, no debe observarse perturbación del medio en los pocillos de la placa.
- Utilice el regulador de gas de dos etapas de alta pureza para este propósito. Ajuste el regulador para reducir la presión interna del(1000 - 2500 PSI) a una presión de suministro de 10 PSI durante todo el experimento. Por lo tanto, de acuerdo con las especificaciones de este regulador de gas, se logró un caudal de 0,00189 metros cúbicos por segundo durante todo el experimento.
- Conecte la tubería de silicona y la válvula distribuidora a un difusor de disco de cerámica ( figura 1J ) dentro del tanque acuático. Cierre el tanque acuático y cierre cuidadosamente la tapa, cubriéndola con grasa de silicona ( Figura 1K ) (compare con la Figura 1 ). Si se requiere una temperatura no ambiente específica, coloque la cámara hipóxica en una incubadora de laboratorio de la temperatura requerida.
- Dependiendo del tipo de embriones utilizados en el experimento, llene el tanque de cámara hipóxica con el medio embrionario apropiado y comience a difundir la mezcla de gases a través del difusor de disco de cerámica. Equilibrar durante 10-15 min.
- Después del equilibrio con thE la mezcla de oxígeno deseada, mida la concentración de oxígeno en el agua usando un oxímetro o una sonda de oxígeno. Aquí, utilice un oxímetro con el sensor de fibra óptica disuelto de oxígeno y temperatura para este propósito.
- Selección cuidadosa de los embriones para el experimento, el uso de embriones enteros y vivos para la incubación de hipoxia. Aquí, nos embriones de rana de etapa 38 o embriones de pez cebra 4 dpf en los experimentos presentados aquí.
- Colocar los platos de embrión en la incubadora ( Figura 1K ) que contiene la cámara de incubación de gas y dejarlos equilibrar a la temperatura de la incubadora.
- Transferir cuidadosamente los embriones en los pocillos de la placa de 24 pocillos en malla ( Figura 1B ) de la cámara de incubación de gas, usando una pipeta de plástico. Utilice siempre una pipeta de plástico para la transferencia de embriones a través del protocolo.
NOTA: Cada pozo de esta placa puede contener hastaA 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra de 4 dpf. Etiquetar cuidadosamente los pozos si se utilizan diferentes genotipos. - Mantener la cámara de incubación de gas bajo una infusión constante con la mezcla gaseosa de elección durante 5 h o durante un tiempo más largo que se adapte al experimento. Utilizar aquí una mezcla de 5% de O $ ₂ $ y 95% de N $ ₂ $.
- Con cuidado, transferir los embriones de la cámara de incubación de gas de nuevo al medio normoxic correspondiente al tipo de embrión e inmediatamente proceder con los pasos 3 o 4.
- Si se requiere un tratamiento normoxico adicional, transfiera cuidadosamente los embriones al medio normoxico correspondiente al tipo embrionario.
3. Control de la inducción exitosa de la hipoxia mediante el seguimiento de los niveles de HIF-1α
- Preparativos
- Preparar 0,4 mg / mL MS222 solución en 0,1x MBS.
- Preparar el tampón de homogeneización: Comprar Radioimmunoprecipitation Tampón de ensayo (RIPA bUffer) para homogeneización de tejido y suplementar la cantidad de tampón necesaria para su experimento con inhibidor de proteasa hasta una concentración final 1: 100 v / v.
- Preparar soluciones para Western blot.
- Preparar 4 x tampón de carga de gel Laemmli: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerol, SDS al 8% v / v, beta-mercaptoetanol al 4% v / v, azul Bromofenol al 0,5% p / v volumen total ddH2 O.
- Preparar 5x tampón de funcionamiento: 15 g de base de Trizma, 72 g de glicina, 5 g de SDS, 1 l de volumen total de ddH 2 O.
- Preparar tampón de transferencia: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glicina, 200 ml de metanol al 100%, 1 l de volumen total de ddH 2 O.
- Preparar 10 x TBST: 5 ml Tris 1 M pH 8,0, 30 ml 5 M NaCl, 2,5 ml Tween 20, 1 L volumen total H 2 O.
- Preparar la solución de bloqueo: 4% p / v de leche desnatada en polvo en 1x TBST.
- Colección de tejido
- Anestesiar los embriones bañándose en una solución de 0,4 mg / ml de MS22216 , 17 y transferirlos a un tubo de reacción de plástico lleno de tampón de homogeneización usando una pipeta de plástico. Utilizar 20 μ l de buffer por embrión. Obsérvese que al menos 5 embriones de rana de etapa 38 ó 7 embriones de pez cebra de 4 dpf son necesarios para determinar un cambio significativo en los niveles de proteína HIF1α.
- Homogeneizar el tejido utilizando un homogeneizador tisular apropiado o un sonicador. Eliminar los residuos por centrifugación (15 min, 13.000 xg, 4 ° C).
- Alternativamente, disecar las retinas de los embriones de rana anestesiados 17 y homogeneizar como se ha indicado anteriormente. Utilizar 20 μl de tampón de homogeneización por 10 retinas.
- Tomar el sobrenadante usando una pipeta, desnaturalizar a 85 ° C durante 5 min y suplementar con tampón de carga de gel de Laemmli hasta una concentración final de 1x v / v ( por ejemplo , añadir 5 μl de tampón Laemmli 4x a 15 μl de homogeneizado). Utilice este sobrenadante para los WesTern blot o congelar las muestras a -20 ° C.
- Mancha occidental
- Cargar las muestras preparadas como se describe en el Paso 3.2 sobre un gel prefabricado al 12% en un sistema de electroforesis usando tampón de funcionamiento 1x v / v. Use una escalera de proteína para determinar el tamaño de la proteína. Transferir las proteínas sobre una membrana de nitrocelulosa (membrana de 0,45 μm) en tampón de transferencia durante 1 h envasado en hielo a 4 ° C, según el protocolo del fabricante.
- Bloquear sitios de unión inespecíficos que incuban la membrana en tampón de bloqueo durante 60 minutos. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST.
- Incubar la membrana en soluciones de anticuerpo anti-HIF-1α de conejo y anti-α-tubulina de ratón diluidas 1: 100 v / v y 1: 5000 v / v, respectivamente, en solución de bloqueo, durante 2,5 h a TA. Siga con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST.
- Para la detección, incubar en cabra anti-conejo y cabra anti-ratón HRP conjugado anticuerpos diluido 1: 1000 v / v en solución de bloqueo durante 1 h.Seguir con 3 x 10 min de lavado en 1x TBST y visualizar la tinción HRP usando un kit comercial y una máquina de revelado de elección.
- Cuantificar la cantidad de proteína HIF1α utilizando la cuantificación digital.
4. Control de la proliferación celular en la hipoxia
- Preparativos
- Preparar solución de EDU 5 mM en el medio de embrión de elección. La solución se puede utilizar inmediatamente o alicuotar y almacenarse a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
- Preparar solución salina tamponada con fosfato (PBS) o comprar PBS a partir de recursos comerciales. Autoclave durante 10 minutos a 115 ° C.
- Preparar soluciones para la detección de la incorporación de EdU.
- Preparar la solución de fijación: 4% v / v de solución madre de formaldehído al 16% en PBS.
- Preparar solución de sacarosa: sacarosa al 30% p / v en PBS.
- Preparar PBST: 0,1% v / v de Triton X-100 en PBS.
- Preparar Solución de bloqueo: 10% v / v Suero de cabra inactivado por calor (HIGS) en PBST.
- Preparar la solución DAPI: 4 ', 6 - diamidino - 2 - fenilindol 1: 1000 v / v (DAPI) en PBST.
- Incubación de embriones en hipoxia para la incorporación de EDU
- Llenar la cámara de incubación de gas con 400-500 mL de solución EDU 5 mM suplementada con 1% v / v de DMSO. Pre-equilibrar la solución con la misma mezcla de gases utilizada en el experimento durante 15 min antes del experimento. Obsérvese que el volumen de la solución de incubación puede minimizarse fijando barras más cortas ( Figura 1E ) a la placa de fondo de malla.
- Conectar la tubería de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla gaseosa de 5% de O 2 y 95% de N 2 . Incubar la solución durante 15 min.
- Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pozos e incubar durante 2 h. Cada pozo puede caber hasta 5 embriones de rana de estadio 38 o hasta 7 embriones de pez cebra 4 dpf.
- Analizar el embriónS para la incorporación de EdU.
- Tiempo de incubación de embriones en hipoxia e incorporación de EDU
- Llene la cámara de incubación de gas con 500 ml de medio de embrión de elección. Conectar el tubo de gas al cilindro de gas que contiene una mezcla de gas de 5% de O 2 y 95% de N 2 y equilibrar el medio con la mezcla de gases durante 15 min.
- Transferir los embriones a la cámara hipóxica, distribuirlos uniformemente entre los pocillos e incubar durante un período de tiempo deseado hasta 48 h. Durante las últimas 1 h, sustituir el medio embrionario con 5 mM EDU solución suplementada con 1% v / v DMSO.
- Transferir los embriones de nuevo a la placa normoxic y analizar para la incorporación EdU.
- Detección y análisis de la incorporación de EDU
- Anestesiar los embriones bañándolos en una solución de 0,4 mg / ml de MS222.
- Transferir los embriones a un vial de vidrio adecuado y fijar mediante la incubación en solución de fijación de 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguir con 3 x 10 min de lavado en PBS. Con cuidado, transfiera los embriones a la solución de sacarosa para la crioprotección del tejido. Incubar durante 4 h o hasta que los embriones se hundan en el fondo del vial de vidrio.
- Incruste los embriones en el medio de incrustación (compuesto óptimo de temperatura de corte). La criosección bloquea inmediatamente con embriones o almacena hasta 14 d a -80 ° C.
- Cryosection los bloques que contienen embriones usando un criostato. Recoja secciones de espesor de 12 μm (embriones de pez cebra) o 16 μm (embriones de rana) en portaobjetos de microscopio y deje secar. Procese cryosections inmediatamente o guarde a -20 ° C por hasta 3 meses.
- Detectar la incorporación de EdU mediante tinción inmunofluorescente usando un kit de química comercial. Preparar la cantidad de Mezcla de Reacción EdU necesaria para el número de criosecciones en el experimento, según lo descrito por el fabricante.
- Para 500 μL de Mezcla de Reacción EdU, use 430 μl de tampón de reacción EdU 1X, 20 mu l de CuSO _ { 4} , 1,2 mu l de azida Alexa Fluor, 50 mu l de aditivo de tampón 1X EdU.
- Lavar las criosecciones una vez con PBS para eliminar el medio de incrustación y 3 x 5 min con PBST para permeabilizar el tejido. Incubar las criosecciones en solución de bloqueo durante 30 min.
- Incubar las criosecciones con la Mezcla de Reacción de EdU durante 1 h y seguidas de 3 x 10 min de lavados en PBST. Se cubren las criosecciones con solución DAPI durante 15 min, seguidas de 3 x 10 min lavados en PBST. Montar las diapositivas con criogénicas teñidas en el medio de montaje, cubrir con cubreobjetos y dejar secar antes de analizar bajo un microscopio fluorescente o almacenar a 4 ° C hasta 1 año.
- Analizar las criosecciones con tinción anti-EdU bajo un microscopio confocal invertido y determinar el número de células EdU-positivas utilizando cuantificación digital.
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Representative Results
El empleo del sistema de cámara hipóxica que aquí se presenta permite estudiar los efectos de la hipoxia individualmente e in vivo en animales vivos enteros. La hipoxia puede ser inducida colocando embriones enteros de sapo o pez cebra en la cámara hipóxica ( Figura 1 ), y realizarse en diferentes combinaciones de condiciones. En la Figura 2 se muestra una imagen de nuestra instalación completa de la cámara de gas. Hemos controlado la concentración de oxígeno en el medio de incubación utilizando un sensor de oxígeno de fibra óptica (2.1.9) en diferentes puntos temporales durante el experimento. Estos datos indican que hemos inducido hipoxia estable (6-6,5% de oxígeno disuelto) a lo largo de nuestros experimentos ( Tabla 1 ).
En primer lugar, hemos evaluado la ubicuidad, así como los niveles de retina de HIF-1 α en normoxia y en la hipoxia como inducida en nuestra cámara hipóxica. HIF - 1 alphaEs una proteína que se estabiliza bajo concentraciones bajas de oxígeno. Se midieron los niveles de HIF-1α en lisados de embriones de rana entera mantenidos bajo concentración normal de oxígeno o sometidos a hipoxia al 5%, y en lisados de sus retinas aisladas. Como se muestra en la Figura 3 , el HIF-1α se estabiliza bajo hipoxia tanto en embriones enteros como en retinas. La estabilización de HIF-1α se consigue en diferentes pocillos de la placa de incubación de fondo de malla ( Figura S1 ).
Como hemos demostrado anteriormente, la hipoxia afecta a la proliferación de progenitores de células progenitoras de la retina en la zona marginal ciliar (CMZ) de la retina [ 13] . Por lo tanto, el monitoreo de la proliferación en la CMZ mediante la incorporación de EdU es un buen marcador para la inducción exitosa de hipoxia. Incubamos embriones en una cámara hipóxica mantenida al 5% de oxígeno y evaluamos la proliferación retiniana como se describe en el Paso 4.2. Como esperabaEd, normoxic retinas de control mostraron tinción intensa EdU en el CMZ, donde progenitores proliferantes residen en ambos rana ( Figuras 4B y 4D ) y embriones de pez cebra ( Figuras 5A y 5C ). Después de la privación de oxígeno en la cámara hipóxica, se observó una fuerte disminución en la proliferación de progenitores CMZ en ambos embriones de rana ( Figuras 4C-4D ) y de pez cebra (Figuras 5B, 5C). Para determinar la extensión del efecto, se realizó un ciclo de tiempo, incubando los embriones en cámara hipóxica durante períodos más largos de hasta 24 h, monitoreando la proliferación por incorporación de EDU como se describe en el Paso 4.3. Podemos demostrar que la disminución de proliferación proliferante de la retina fue aguda y mayor en 2 h, y persistió durante muchas horas ( Figura 4D ), mientras que los embriones se desarrollaron normalmente de acuerdo a su etapa de desarrollo. Este resultado sugiere que nuestro sistema puede inducir eficientemente hipoxia en un objetivo tiSsue de interés, a corto tiempo de incubación, así como mantener estas condiciones por períodos más largos, mientras que el apoyo normal desarrollo embrionario.
Figura 1: Representación esquemática de la configuración experimental de la cámara de gas. ( B ) placa de 24 pocillos de fondo de malla (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm de diámetro de pozo) ( C ) nilón Filtro con un diámetro de malla de 0,1-0,2 mm ( D ) Túneles de 10 (longitud) x 5 mm (diámetro) ( E ) Tubos de teflón o PVC de diámetro apropiado y tubo de silicona de 30 mm de longitud ( F ) La válvula de gas ( I ) válvula de distribución ( I ) deseada de oxígeno / CO $ ₂ $ ( H )Difusor de disco amico ( K ) tapa del tanque. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Una imagen de la instalación experimental de cámara de gas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Medición de la concentración de oxígeno en diferentes tiempos de incubación en la cámara de gas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de este f Igure.
Figura 3: Los niveles de HIF-1α aumentan tras la inducción de hipoxia en los embriones de Xenopus y sus retinas. Western blots de lisados de proteínas de embriones enteros ( A ) o de retinas embrionarias ( B ) aisladas mantenidas bajo concentraciones normales de oxígeno o en hipoxia. Se examinaron las manchas para la subunidad HIF-1α y la α-tubulina. Se tomaron por lo menos 5 embriones o 22 retinas para cada condición ( n = 5) ( C, D ). Cuantificación de la transferencia de Western realizada en ( A, B ), respectivamente. Los niveles de proteına de HIF-1α se normalizaron a los niveles de proteına de α-tubulina. Las barras de error representan desviaciones estándar entre experimentos. * P- valor <0,05, *** p- valor <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La hipoxia disminuye la proliferación de progenitores en el nicho de células madre de la retina de los embriones de rana. ( A ) Representación esquemática de una sección transversal a través de una retina de Xenopus de 38 etapas, indicando la posición de la incorporación EdU de la zona marginal ciliar (CMZ) ( B , C ) medida después de un pulso EDU de 2 h en retinas teñidas con DAPI de 38 etapas Embriones de rana mantenidos bajo normoxia ( B ) o en la cámara hipóxica ( C ). Magenta = tinción DAPI; Gris = EdU mancha. Barras de escala = 50 μm ( D ) Cuantificación del experimento realizado en B y C. Las barras de error representan desviaciones estándar. ***
Figura 5: La hipoxia disminuye la proliferación de progenitores en el nicho de células madre de la retina de 4 dpf Zebrafish embriones. EDU medido después de un pulso EdU de 2 h en retinas manchadas con DAPI de 4 dpf de embriones de pez cebra WTe mantenidosNormoxia ( A ) o en la cámara hipóxica ( B ). Magenta: tinción DAPI; Gris: EdU mancha. Barras de escala = 50 μm ( C ) Cuantificación del experimento realizado en B y C. Las barras de error representan desviaciones estándar. *** valor p <0,001; N = 7. Para cada condición se cuantificaron 10-15 retinas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 1: Los niveles de HIF-1α aumentan con la inducción de hipoxia de manera consistente en diferentes pocillos de la placa y entre diferentes experimentos. Las transferencias de Western de lisados proteicos de embriones enteros de Xenopus mantenidos bajo concentraciones normales de oxígeno oEn dos pocillos diferentes de la cámara hipóxica bajo inducción de hipoxia durante 2 horas en el experimento 1 ( A ) o en el experimento 2 ( B ). Se examinaron las manchas para la subunidad HIF-1α y la α-tubulina. 5 embriones de rana del estadio 38 fueron tomados para cada condición. Los experimentos 1 y 2 son repeticiones biológicas independientes ( C, D ). Cuantificación de las transferencias de Western realizadas en ( A, B ), respectivamente. Los niveles de proteına de HIF-1α se normalizaron a los niveles de proteına de α-tubulina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí hemos presentado un nuevo pero fácil método robusto para inducir hipoxia que se ajusta para su uso con los embriones de sapo y pez cebra, pero también puede ser adecuado para otros organismos acuáticos. La principal ventaja de este método reside en su simplicidad y rentabilidad. Sin embargo, los resultados obtenidos con este método son muy robustos. Hemos demostrado que la hipoxia puede ser inducida eficientemente en la cámara tanto en embriones enteros como en tejido específico - aquí, retinas. Para determinar la efectividad de la inducción de hipoxia, hemos monitoreado los niveles de proteína HIF-1α en embriones enteros y lisados de retina. De acuerdo con nuestros resultados, la inducción de hipoxia puede considerarse exitosa si se puede observar un aumento de los niveles de HIF-1α al cabo de 1 h en la cámara hipóxica comparado con el control normoxic y normalizado con los niveles globales de proteínas, por ejemplo , usando los niveles de α-tubulina Como control. Se confirmó la actividad de la hipoxia en el tejido mediante el monitoreo de la proliferación de células madreDe acuerdo con nuestros resultados previamente publicados 13 , que la hipoxia inducida usando la disposición presentada aquí conduce a una disminución de la proliferación de células madre de la retina en los dos embriones de sapo y pez cebra.
Uno de los pasos críticos de este protocolo es asegurar que la cámara hipóxica esté bien sellada. Esto se logra utilizando un sello apropiado en la tapa del tanque, que fue grasa de silicona en nuestro caso. Además, la colocación dentro de una incubadora ayudará a evitar la fuga de oxígeno atmosférico en la cámara, proporcionando una barrera adicional. Una medición de la concentración de oxígeno con una sonda o electrodo apropiado también asegura que los niveles de oxígeno hipóxico se mantengan estables y sin fluctuaciones. Además, se debe tener cuidado para evitar la apertura de la cámara durante largos períodos de tiempo mientras se intercambian soluciones o muestras entre experimentos.
Dado rápido equilPara mantener el sistema incluso durante periodos de tiempo más largos que los descritos en los resultados representativos (24 h), se necesita una cantidad pequeña de la mezcla gaseosa y un caudal de gas bajo para los tiempos de 10 a 15 min para el establecimiento de hipoxia. Las soluciones utilizadas en el experimento deben ser pre-equilibradas para lograr la hipoxia durante 15 minutos antes de la incubación en la cámara (como se describe en 4.2.1). Hemos utilizado la cámara hipóxica durante 48 h de hipoxia constante sin errores como se observa en nuestras mediciones de concentración de oxígeno ( Tabla 1 ). Debe observarse que la correcta difusión de gas debe ser controlada durante tiempos de incubación más largos. Por último, se debe tener cuidado al colocar los embriones en los pozos (Paso 2.2.1.) Para evitar la mezcla de embriones de diferentes animales mutantes / condiciones experimentales. Esto es bastante simple de conseguir dadas las paredes relativamente altas de los pocillos individuales de la placa.
A pesar de ser una persona sencilla pero eficazY el sistema robusto para la inducción de hipoxia, el uso de la cámara descrita aquí tiene un inconveniente para los experimentos que requieren el uso de soluciones de incubación costosas y medios. El volumen mínimo de los medios en el tanque de la cámara no debe caer por debajo de 400 mL. Sin embargo, se pueden hacer ajustes para adaptarse a volúmenes más bajos: Hemos logrado ajustar la longitud de las varillas ( Figura 1E ) unidas a la placa (2.1.4 y 4.2.1) de manera que requeriríamos sólo 50 ml de medio / solución . Aunque no es ideal para tiempos de incubación más largos, esta configuración puede ajustarse a la misma tubería de gas y puede sellarse apropiadamente para asegurar suficiente hipoxia durante un máximo de 8 horas.
En conjunto, nuestra configuración de cámara de gas se puede emplear para su uso con cualquier organismo modelo acuático y se diferencia de otros sistemas comerciales similares por su simplicidad, rentabilidad y robustez. Una vez dominado, puede ser utilizado para experimentos directos in vivo , en cualquier período de tiempo dado y bajo cualquier deseoD atmósfera de gas incluyendo hipoxia, hiperoxia u otras mezclas de gases.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Premio de Apoyo Wellcome Trust SIA 100329 / Z / 12 / Z a WAH y la beca de DFG KH 376 / 1-1 concedida a HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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