Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon
Summary
Vi introducerar ett nytt hypoxisk kammarsystem för användning med vattenlevande organismer som groda och zebrafiskembryon. Vårt system är enkelt, robust, kostnadseffektivt och möjliggör induktion och upprätthållande av hypoxi in vivo och upp till 48 timmar. Vi presenterar 2 reproducerbara metoder för att övervaka hypoxiens effektivitet.
Abstract
Här introducerar vi ett nytt system för hypoxi-induktion, som vi utvecklat för att studera effekterna av hypoxi hos vattenlevande organismer som groda och zebrafiskembryon. Vårt system består av en kammare med en enkel installation som ändå är robust för att inducera och behålla en specifik syrekoncentration och temperatur i valfri experimentell lösning. Det presenterade systemet är mycket kostnadseffektivt men mycket funktionellt, vilket möjliggör induktion och upprätthållande av hypoxi för direkta experiment in vivo och under olika tidsperioder upp till 48 timmar.
För att övervaka och studera effekterna av hypoxi har vi använt två metoder: mätning av nivåer av hypoxi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1a) i hela embryon eller specifika vävnader och bestämning av retinala stamcellsproliferation med 5-etynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA. HIF-1a-nivåer kan fungera som en allmän hypoxi-markör i hela embryot eller vävnadenValfritt, här embryonalt näthinna. EdU-inkorporering i de prolifererade cellerna i embryonalt näthinnan är en specifik utgång av hypoxi-induktion. Således har vi visat att hypoxiska embryonala retinala progenitorer minskar proliferation inom 1 timmars inkubation under 5% syre av både groda och zebrafiskembryon.
När vi har behärskat kan vår setup användas för användning med små vattenmodellorganismer, för direkta in vivo- experiment, vilken tid som helst och under normal, hypoxisk eller hyperoxisk syrekoncentration eller under någon annan given gasblandning.
Introduction
Hypoxiforskning har många tillämpningar. Dessa innefattar att undersöka patogenesen och utveckla behandlingar för medicinska tillstånd som kännetecknas av hypoxi 1 och akut höghöjdssjukdom 2 . Hypoxisk stress orsakar stora metaboliska förändringar i alla organismer som kräver syre. Hypoxisk stress påverkar också fostrets tillväxt och utveckling och patogenesen hos flera humana sjukdomar, inklusive intrauterin tillväxtrestriktion 3 . Hypoxisk stress kan inte bara leda till minskad födelsevikt, foster- och neonatal mortalitet, men kan också leda till många komplikationer i vuxenlivet, såsom hjärt-kärlsjukdom, typ 2-diabetes, fetma och högt blodtryck 4 . Hypoxisk stress observeras också ofta vid fast tumörutveckling, när tumörvävnaden växer ut sin blodtillförsel. Det är därför viktigt att kunna studera effekterna av hypoxi in vivo och direkt under embr Yonisk utveckling.
Bland de mest kända metoder som har använts för att studera effekter av hypoxi under utveckling är användningen av koboltklorid i tillväxtmediet eller inkubation av organismen i en hypoxisk kammare. Koboltklorid inducerar artificiellt ett hypoxiskt svar under normal syrekoncentration på grund av dess roll i stabiliseringen av hypoxi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1a) genom att förhindra dess proteosomala nedbrytning 5 , 6 , 7 . En lämplig metod 8 kan användningen av koboltklorid liksom andra liknande kemiska hypoximimetika emellertid ha ospecifik skadlig effekt på celler och vävnader, t ex apoptos 9 . Därför är hypoxiska kamrar en bättre metod för induktion av "naturlig hypoxi" i levande organismer genom normal utveckling.
Ntent "> Vi har fokuserat på att utveckla ett system för induktion av hypoxi hos vattenlevande embryon. Både grodor och zebrafisk har nu blivit informativa vertebratmodellorganismer för studier av många biologiska processer, liksom modeller för olika mänskliga sjukdomar. Frog och zebrafish embryon Utvecklas externt, eliminerar komplikationen av maternell kompensation. Vidare gör en snabb utvecklingskurs det möjligt att manipulera miljöfaktorer och observera fenotypiska förändringar i organbildning i realtid. Dessutom är många komponenter i de stora signaltransduktionsvägarna mycket konserverade i Dessa modellorganismer och har präglats i detalj av en stor litteratur. Den största fördelen med att använda grodor och zebrafiskembryon för att studera effekterna av hypoxi vid utveckling av ryggradsdjur är att alla processer kan övervakas direkt, eftersom syre snabbt tränger igenom embryon. Således, i grodor och sebrafisk, som i motsats till andra modellorganismer såsomMusembryon kan påverkan av en specifik syrekoncentration studeras i vävnad av intresse utan att ta hänsyn till förekomsten eller bristen på funktionell vaskulatur.De flesta kommersiellt tillgängliga inställningarna för hypoxisk inkubation har nackdelen med att vara jämförbart stora och med motsvarande höga löpande kostnader. Bortsett från deras höga initialkostnads- och gasförbrukning kräver jämviktning och underhåll av vanliga hypoxikamrar en konstant hypoxisk atmosfär mot gasgradienten som naturligt uppträder i dessa kamrar på grund av deras större storlek och / eller organismens andning. Detta kräver anställning av gasfläktar och ett kylsystem, vilket ökar mängden ytterligare nödvändig utrustning, hindrar forskarens fingerfärdighet och övergripande minskar enkelheten i försöksproceduren. Däremot är den inställning vi presenterar här jämförbar, men mycket kostnadseffektiv, liten, lätt att etablera och tillåter fAst gas jämviktning, stabil hypoxisk atmosfär och enkel utbyte av material och lösningar i kammaren. Vårt system kan användas för användning med någon vattenmodellorganisme av intresse.
Vi har konstruerat en hypoxisk kammare som är bekvämt liten och kan därför placeras inuti en gemensam laboratorieinkubator, vilket lätt tillåter experimentella procedurer vid vilken temperatur som helst. Genom att tillhandahålla bekväm kontroll över såväl temperatur som syrekoncentration i mediet ligger fördelen med vårt system mot de kommersiellt tillgängliga hypoxi-inkubatorerna i sin lilla storlek och kostnadseffektivitet. Således kan vår installation etableras med hjälp av generella laboratorietillförselar som är tillgängliga för de flesta forskningslaboratorier och kräver inga dyra material. Dessutom genererar vår inställning inte värme, till skillnad från kommersiellt tillgängliga hypoxi inkubatorer, och tillåter användning vid temperaturer lägre än rumstemperatur placeras i en inkubator. LaSt är särskilt kritisk för arbetet med kallblodiga organismer som grodor och fiskar där utvecklings- och metaboliska räntor är starkt temperaturberoende.
Att vara mycket kostnadseffektiv och lätt byggd är vår gasinkubationskammare ändå väldigt mångsidig när det gäller att etablera olika hypoxiska eller hyperoxiska förhållanden, samt möjliggöra snabb och enkel administrering av olika media och lösningar för ett stort antal experimentella förhållanden. Dessutom använder vårt system en 24-brunnskiva i stället för vanliga diskar eller laboratorietankar 10 , 11 , 12 , och möjliggör observation och experimentell behandling av flera mutantförhållanden samtidigt.
För att kontrollera för korrekt induktion av hypoxi har vi övervakat nivåerna av HIF-1a-proteinet genom Western blot-detektion. Dessutom är antalet prolifererade celler före och efter inkubationN i den hypoxiska kammaren kan användas för att bestämma om hypoxi har inducerats i vävnaden. Denna metod är baserad på våra tidigare publicerade resultat 13 , vilket visar att proliferation i njurarna hos embryonala retinala stamceller minskar vid induktion av hypoxi. Således har vi övervakat nivån av retinala stamcellsproliferation genom tillsats av 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EdU) till embryomediet och mätning av dess införlivande i DNA-ningen av nyförbredande celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi presenterat en enkel men robust ny metod för att framkalla hypoxi som är anpassad för användning med frö och zebrafiskembryon, men kan också passa för andra vattenlevande organismer. Den största fördelen med denna metod ligger i dess enkelhet och kostnadseffektivitet. Ändå är de resultat som uppnås med denna metod mycket robusta. Vi har visat att hypoxi effektivt kan induceras i kammaren både i hela embryon såväl som i specifik vävnad – här, retinas. För att bestämma effekten av hypoxi-in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av supporten från Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z till WAH och DFG-stipendiet KH 376 / 1-1 tilldelade HK
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
- Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
- Grant, S., et al. Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?. Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).
- Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation. PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).
- Ong, K. K., Dunger, D. B. Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults. Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).
- Maxwell, P., Salnikow, K. HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor. Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).
- Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).
- Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).
- Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models. Disease Models & Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).
- Guo, M., et al. Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms. Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).
- Woods, I. G., Imam, F. B. Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish. Genom Data. 6, 83-88 (2015).
- Rouhi, P., et al. Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish. Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).
- Stevenson, T. J., et al. Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium. PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).
- Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway. J Dev Biol. 4 (2), (2016).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).
- McDonough, M. J., et al. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. JoVE. (70), (2012).
