Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Summary

Vi introduserer et nytt hypokalsystem for bruk med vannlevende organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system er enkelt, robust, kostnadseffektivt og muliggjør induksjon og opprettholdelse av hypoksi in vivo og i opptil 48 timer. Vi presenterer 2 reproduserbare metoder for å overvåke effekten av hypoksi.

Abstract

Her introduserer vi et nytt system for hypoksi-induksjon, som vi utviklet for å studere effekten av hypoksi i akvatiske organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system består av et kammer som har et enkelt oppsett som likevel er robust til å indusere og opprettholde en bestemt oksygenkonsentrasjon og temperatur i en hvilken som helst eksperimentell løsning. Det presenterte systemet er svært kostnadseffektivt men svært funksjonelt, det tillater induksjon og opprettholdelse av hypoksi for direkte eksperimenter in vivo og i ulike tidsperioder opptil 48 timer.

For å overvåke og studere effekten av hypoksi har vi benyttet to metoder – måling av nivåer av hypoksi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoer eller spesifikke vev og bestemmelse av retinalt stamcelleproliferasjon med 5-etynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA. HIF-1α nivåer kan tjene som en generell hypoksi markør i hele embryoet eller vevetAv valg, her embryonalt nese. EdU-inkorporering i de prolifererende celler av embryonalt retina er en spesifikk utgang av hypoksi-induksjon. Dermed har vi vist at hypoksiske embryonale retinale progenitorer reduserer proliferasjon innen 1 time inkubering under 5% oksygen av både frosk og zebrafiskembryoer.

Når vi har mestret, kan vårt oppsett brukes til bruk med små organismer av vannmodell, for direkte in vivo eksperimenter, i en gitt tidsperiode og under normal, hypoksisk eller hyperoksisk oksygenkonsentrasjon eller under en hvilken som helst annen gitt gassblanding.

Introduction

Hypoksiforskning har mange anvendelser. Disse inkluderer undersøkelse av patogenesen og utvikling av behandlinger for medisinske tilstander preget av hypoksi ¹ og akutt høyhøye sykdom ² . Hypoksisk stress forårsaker store metabolske forandringer i alle organismer som krever oksygen. Hypoksisk stress påvirker også føtal vekst og utvikling og patogenesen av flere humane sykdommer, inkludert intrauterin vekstrestriksjon ³ . Hypoksisk stress kan ikke bare føre til redusert fødselsvekt, føtal og nyfødt dødelighet, men kan også resultere i mange komplikasjoner i voksenlivet, for eksempel kardiovaskulær sykdom, type 2 diabetes, fedme og hypertensjon ⁴ . Hypoksisk stress blir også ofte observert under solid tumorutvikling, når svulstvevet vokser ut blodtilførselen. Det er derfor viktig å kunne studere effekten av hypoksi in vivo og direkte under embr Yonisk utvikling.

Blant de mest kjente metoder som har vært ansatt for å studere effekter av hypoksi under utvikling er bruken av koboltklorid i vekstmediet eller inkubasjon av organismen i et hypoksisk kammer. Kobolklorid fremkaller kunstig en hypoksisk respons under normal oksygenkonsentrasjon, på grunn av sin rolle i stabiliseringen av hypoksi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1a) ved å forhindre dets proteosomale nedbrytning ^{5 , 6 , 7} . Imidlertid, som en praktisk metode ⁸ , kan bruken av koboltklorid samt andre lignende kjemiske hypoksymimetika ha uspesifisert skadelig virkning på celler og vev, for eksempel apoptose ⁹ . Derfor er hypoksiske kamre en bedre metode for induksjon av "naturlig hypoksi" i levende organismer i løpet av normal utvikling.

Ntent "> Vi har fokusert på å utvikle et system for induksjon av hypoksi i akvatiske embryoer. Både frosker og sebrafisk har nå blitt informative vertebratmodellorganismer for studier av mange biologiske prosesser, samt modeller for ulike menneskersykdommer. Frog- og sebrafiskembryoer Utvikle seg eksternt, eliminere komplikasjonen av maternell kompensasjon. Videre gjør et raskt utviklingsløp det mulig å manipulere miljøfaktorer og observere fenotypiske forandringer i organdannelsen i sanntid. I tillegg er mange komponenter i de store signaltransduksjonsbanene sterkt konserverte i Disse modellorganismer og har blitt karakterisert i detalj av en stor litteratur. Hovedfordelen ved bruk av frosker og zebrafiskembryoer for å studere effekten av hypoksi på vertebratutvikling er at alle prosesser kan overvåkes direkte, siden oksygen raskt trenger inn i embryoene. Dermed i frosker og sebrafisk, som i motsetning til andre modellorganismer somMusembryoer, kan påvirkning av en bestemt oksygenkonsentrasjon studeres i vev av interesse uten å ta hensyn til forekomsten eller mangelen på funksjonell vaskulatur.

De fleste kommersielt tilgjengelige oppsett for hypoksisk inkubasjon har ulempen ved å være sammenlignbart store og har tilsvarende høye løpekostnader. Bortsett fra deres høye initialkostnad og gassforbruk krever ekvilibrering og vedlikehold av vanlige hypoksiekamre opprettholdelse av konstant hypoksisk atmosfære mot gassgradienten som naturlig forekommer i disse kamrene på grunn av deres større størrelse og / eller organisasjonsånding. Dette krever sysselsetting av gassfans og et kjølesystem, noe som øker mengden ekstra nødvendig utstyr, hindrer forskers fingerfylling og generelt reduserer enkelheten i eksperimentell prosedyre. I motsetning til dette er oppsettet vi presenterer her, sammenlignbart robust, men svært kostnadseffektivt, lite, lett å etablere og tillater fAst-gassekvilibrering, stabil hypoksisk atmosfære og enkel utveksling av materialer og løsninger i kammeret. Vårt system kan brukes til bruk med en vannmiljøorganisme av interesse.

Vi har konstruert et hypoksisk kammer som er bekvemt lite og kan derfor plasseres inne i en felles laboratorieinkubator, som lett tillater eksperimentelle prosedyrer ved en bestemt temperatur. For å gi praktisk kontroll over både temperatur og oksygenkonsentrasjon i mediet ligger fordelen av systemet vårt mot de kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorene i sin lille størrelse og kostnadseffektivitet. Dermed kan vårt oppsett etableres ved hjelp av generelle laboratorieforsyninger tilgjengelig for de fleste forskningslaboratorier og krever ikke dyre materialer. I tillegg genererer oppsettet ikke varme, i motsetning til kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorer, og tillater bruk ved temperaturer lavere enn romtemperaturen blir plassert i en inkubator. LaSt er spesielt kritisk for arbeidet med kaldblodige organismer som frosker og fisk der utviklings- og metabolskrate er sterkt temperaturavhengige.

Å være svært kostnadseffektiv og lett bygget, er vårt gassinkubasjonskammer likevel svært allsidig når det gjelder å etablere ulike hypoksiske eller hyperoksiske forhold, samt muliggjøre rask og enkel administrasjon av forskjellige medier og løsninger for et stort antall eksperimentelle forhold. I tillegg bruker vi en brønn på 24 brønner i stedet for vanlige retter eller laboratorietanker ^{10 , 11 , 12} , og lar oss observere og eksperimentelle behandling av flere mutantforhold samtidig.

For å kontrollere for korrekt induksjon av hypoksi, har vi overvåket nivåene av HIF-1a-proteinet ved Western blot-deteksjon. I tillegg er antallet prolifererende celler før og etter inkubasjonN i det hypoksiske kammeret kan brukes til å avgjøre om hypoksi har blitt indusert i vevet. Denne metoden er basert på våre tidligere publiserte resultater ¹³ , som viser at spredning i embryonal retinal stamcelle nisje reduseres ved induksjon av hypoksi. Dermed har vi overvåket nivået av retinalt stamcelleproliferasjon ved å tilsette 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) til embryo-mediumet og måle dets innlemmelse i DNA'et av nylig prolifererende celler.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjer for dyrepleie ved Universitetet i Cambridge. 1. Dyrevedlikehold Froskembryoer MERK: Embryoer kan heves og opprettholdes i henhold til dyre- og laboratorieanlegget. Her er et eksempel på vedlikehold av dyr beskrevet. Klargjør 0.1x Modifisert Barths Solution (MBS) løsning: 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHC03, 100 μM HEPES, 8,2 μM MgS04, 3,3 μM Ca (NO3) 2 og 4,1 μM CaCl2, pH 7,6 . Skaff Xenopus l…

Representative Results

Ved å bruke det hypoksiske kammersystemet som vi presenterer her, kan vi undersøke effekten av hypoksi enkeltvis og in vivo hos hele levende dyr. Hypoksi kan induseres ved å plassere hele frosk- eller sebrafiskembryoer i det hypoksiske kammeret ( Figur 1 ), og gjennomføres på forskjellige kombinasjoner av forhold. Et bilde av vårt gjennomførte gasskammeroppsett er vist på figur 2 . Vi har overvåket oksygenkonse…

Discussion

Her har vi presentert en enkel, men robust ny metode for å indusere hypoksi som er justert for bruk med frosk- og sebrafiskembryoer, men kan også være egnet for andre akvatiske organismer. Den største fordelen med denne metoden ligger i sin enkelhet og kostnadseffektivitet. Likevel er resultatene oppnådd med denne metoden svært robuste. Vi har vist at hypoksi kan effektivt framkalles i kammeret både i hele embryoer og i spesifikt vev – her, retina. For å fastslå effektiviteten av hypoksi-induksjonen har vi over…

Materials

Sodium chloride	Sigma	S7653	NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST
Potassium chloride	Sigma	P9333	KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu,
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761	NaHCO3 / 0.1X MBS
HEPES	Sigma	H3375	0.1X MBS
Magnesium sulfate	Sigma	M7506	MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium
Calcium nitrate	Sigma	202967	Ca (NO3)2 / 0.1X MBS
Calcium chloride	Sigma	C1016	CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium
Methylene blue	Sigma	M9140	Embryo medium
Pregnant mare serum gonadotropin	Sigma	CG10	frog fertilization
Zebrafish breeding tank	Carolina	161937	gas chamber construction
24-well plate	Thermo Scientific	142475	Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
Epoxy resin	RS Components UK	Kit 199-1468
Gas distributor valve	WPI Luer Valves	Kit 14011	aquatic tank attachment (Schema 1, H)
High precision gas valve	BOC	200 bar HiQ C106X/2B	gas tank attachment (Schema 1, I)
5% oxygen and 95% N2 gas tank	BOC	226686-L	hypoxic gas mixture
ceramic disc diffuser	CO2 Art	Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005	Schema 1, J
silicone grease	Scientific Laboratory Supplies	VAC1100	Schema 1, K
oxymeter	Oxford Optronix	Oxylite, CP/022/001	hypoxic chamber setup
fibre-optic dissolved oxygen sensor	Oxford Optronix	HL_BF/OT/E	hypoxic chamber setup
plastic pasteur pipette	Sterilin	STS3855604D	for embryo transfer
MS222	Sigma Aldrich	E10521-50G	embryo anesthetic
RIPA buffer	Sigma	R0278-50ML	tissue homogenization
Protease inhibitor	Sigma	P8340	tissue homogenization
Tris	Sigma	77-86-1	4X Laemmli loading buffer, 10X TBST
Glycerol	Sigma	G5516	4X Laemmli loading buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma	L3771	SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer
beta-Mercaptoethanol	Sigma	M6250	4X Laemmli loading buffer
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126	4X Laemmli loading buffer
Trizma base	Sigma	77-86-1	5X Running buffer, Transfer buffer
Glycine	Sigma	G8898	5X Running buffer, Transfer buffer
Methanol	Sigma	34860	Transfer buffer
Tween 20	Sigma	P2287-500ML	10X TBST
skim milk powder	Sigma	70166	Blocking Solution
Eppendorf microcentrifuge tube	Sigma	T9661
tissue homogenizer	Pellet Pestle Motor Kontes	Z359971	tissue homogenization
pellet pestles	Sigma	Z359947-100EA	tissue homogenization
precast 12% gel	Biorad	Mini-ProteinTGX, 456-1043	Western Blot
protein ladder				Amersham	Full-Range Rainbow ladder, RPN800E	Western Blot
nitrocellulose membrane (0.45 µm)	Biorad	162-0115	Western Blot
anti-HIF-1α antibody	Abcam	ab2185	Western Blot
anti-α-tubulin antibody	Sigma	T6074	Western Blot
goat anti-rabbit antibody	Abcam	ab6789	Western Blot
goat anti-mouse antibody	Abcam	ab97080	Western Blot
Pierce ECL 2 reagent	Thermo Scientific	80196	Western Blot
ECL films Hyperfilm	GE Healthcare Amersham	28906837	Western Blot
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine	santa cruz	CAS 61135-33-9	EdU, EdU incorporation
Phosphate-buffered Saline	Oxoid	BR0014G	1X PBS
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908	Fixation solution
Sucrose	Fluka	S/8600/60	Solution solution
Triton X-100	Sigma	T9284-500ML	PBST
Heat-inactivated Goat Serum	Sigma	G6767-100ml	HIGS, Blocking solution (EdU incorporation)
4',6-diamidino-2-phenylindole	ThermoFisher Scientific	D1306	DAPI, EdU incorporation
Dimethyl sulfoxide	Molecular Probes	C10338	DMSO, EdU incorporation
glass vial	VWR	98178853	EdU incorporation analysis
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound	Scigen	4563	embedding medium, EdU incorporation analysis
cryostat Jung Fridgocut 2800E	Leica	CM3035S	EdU incorporation analysis
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass	Thermo Scientific	J1800AMNZ	EdU incorporation analysis
EdU Click-iT chemistry kit	Molecular Probes	C10338	EdU incorporation analysis
FluorSave	Calbiochem	D00170200	mounting medium, EdU incorporation analysis
coverslips	VWR	ECN631-1575	EdU incorporation analysis
fluorescent microscope	Nikon	Eclipse 80i	EdU incorporation analysis
confocal scanning microscope	Olympus	Fluoview FV1000	EdU incorporation analysis
Volocity software	PerkinElmer	Volocity 6.3	EdU incorporation analysis