生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導
Summary
我々は、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物に使用するための新しい低酸素チャンバーシステムを紹介します。私たちのシステムはシンプルで頑丈で、費用効果が高く、インビボで48時間まで低酸素症の誘導と持続が可能です。低酸素症の有効性をモニターする2つの再現可能な方法を提示する。
Abstract
ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚などの水生生物における低酸素の影響を研究するために開発した低酸素誘導のための新しいシステムを紹介します。私たちのシステムは、簡単なセットアップを特長とするチャンバーで構成されていますが、実験ソリューションの中で特定の酸素濃度と温度を誘導し維持するには堅牢です。提示されたシステムは非常に費用対効果が高いが、高度に機能的であり、インビボおよび48時間までの様々な期間の直接的実験のための低酸素の誘導および持続を可能にする。
低酸素症の影響をモニターし、研究するために、全胚または特定の組織における低酸素誘導因子1アルファ（HIF-1α）のレベルの測定、および5-エチニル-2'-デオキシウリジンによる網膜幹細胞増殖の測定、デオキシウリジン（EdU）をDNAに組み込む。 HIF-1αレベルは、全胚または組織中の一般的な低酸素症マーカーとして働くことができるここでは胚性網膜です。胚性網膜の増殖細胞へのEdU取り込みは、低酸素誘導の特異的産物である。したがって、我々は、低酸素胚性網膜前駆細胞が、カエルおよびゼブラフィッシュの両方の胚の5％酸素下でのインキュベーションの1時間以内に増殖を減少させることを示した。
習得したら、私たちの設定は、小さな水生生物、直接的なインビボ実験、任意の所与の期間、正常、低酸素または高酸素酸素濃度下で、または任意の他の所定のガス混合物で使用することができる。
Introduction
低酸素症の研究には多くの用途があります。これらには、低酸素症1および急性高病気2を特徴とする病状の病因の調査および治療の開発が含まれる2 。低酸素ストレスは、酸素を必要とする全ての生物において主要な代謝変化を引き起こす。低酸素ストレスは、子宮内発育制限を含むいくつかのヒト疾患の胎児の成長および発育および病因にも影響する3 。低酸素ストレスは、出生時体重、胎児および新生児死亡率の低下につながるだけでなく、心血管疾患、2型糖尿病、肥満および高血圧のような成人においても多くの合併症を引き起こす可能性があります4 。低酸素ストレスは、腫瘍組織がその血液供給を超えて増殖する固形腫瘍発生の間にしばしば観察される。したがって、インビボでの低酸素症の影響を直接的に調べることが重要であるヨニック開発。
発生中の低酸素の影響を研究するために用いられてきた最もよく知られている方法の中には、増殖培地中での塩化コバルトの使用または低酸素室での生物のインキュベーションがある。塩化コバルトは、低酸素誘導性因子-1アルファ（HIF-1α）のプロテオソーム分解を防止することによる安定化の役割のために、通常の酸素濃度下で人工的に低酸素応答を誘導する5,6,7。しかしながら、簡便な方法8であることから、塩化コバルトおよび他の同様の化学的低酸素擬態物の使用は、細胞および組織、 例えばアポトーシス9に非特異的有害な効果を有し得る。したがって、低酸素室は、正常な発達過程を経て、生体内の「自然低酸素症」を誘導するより良い方法です。
ntent ">水生動物胚の低酸素誘導系の開発に注力してきたカエルとゼブラフィッシュの両方は、様々な生物学的過程の研究のための有益な脊椎動物モデル生物であり、様々なヒト疾患のモデルでもあります。母体の補償の合併症を排除し、外的に発達させ、母親の補償の合併症を排除することができます。また、早期開発により、環境因子を操作し、臓器形成における表現型の変化をリアルタイムで観察することができます。カエルとゼブラフィッシュの胚を用いて脊椎動物の発生に及ぼす低酸素の影響を研究することの主な利点は、酸素が迅速に胚に浸透するため、すべてのプロセスを直接監視することができることです。したがって、カエルおよびゼブラフィッシュでは、他のモデル生物とは対照的に、機能的脈管構造の存在または欠如を考慮することなく、目的の組織において特異的酸素濃度の影響を研究することができる。低酸素インキュベーションのための市販されているほとんどのセットアップは、比較的に大きく、それに対応して高いランニングコストを有するという欠点を有する。それらの初期初期費用およびガス消費量が高いことを除けば、一般的な低酸素症室の平衡および維持は、より大きなサイズおよび/または生物呼吸のためにこれらの室で自然に生じるガス勾配に対して一定の低酸素雰囲気の維持を必要とする。これにはガスファンと冷却装置の使用が必要となり、設備の追加が増え、研究者の手間がかかりにくくなり、実験手順が単純になります。対照的に、ここに示す設定は、比較的堅牢ですが、非常に費用対効果が高く、小さく、確立しやすく、f安定した低酸素雰囲気およびチャンバ内の材料および溶液の簡単な交換を可能にする。我々のシステムは、関心のある任意の水生生物に使用することができます。
私たちは、好都合に小さく、従って任意の特定の温度で実験手順を容易に可能にする共通の実験室インキュベータ内に置くことができる低酸素室を構築した。培地中の酸素濃度と同様に温度の便利な制御を提供することにより、市販の低酸素インキュベーターに対する我々のシステムの利点は、小型でコスト効率にある。したがって、大部分の研究室で利用可能な一般的な研究室用品を使用して設定することができ、高価な材料を必要としません。さらに、市販の低酸素インキュベーターとは異なり、我々のセットアップでは熱が発生せず、インキュベーターに入れた室温より低い温度での使用が可能です。ラ発生および代謝速度が温度に大きく依存するカエルおよび魚のような冷血生物の研究にとって特に重要である。
それにもかかわらず、当社のガスインキュベーションチャンバーは、非常に費用対効果が高く簡単に構築できるため、様々な低酸素状態または高酸素状態を確立する上で非常に用途が広く、膨大な数の実験条件に対して様々な培地および溶液を迅速かつ容易に投与できます。さらに、一般的に使用される皿または実験室用タンク10,11,12の代わりに24ウェルプレートを使用することにより、本発明者らのシステムはいくつかの変異体条件の観察および実験的処理を一度に可能にする。
低酸素症の正確な誘導を制御するために、我々はウエスタンブロット検出によってHIF-1αタンパク質のレベルをモニターした。さらに、インキュベーション前後の増殖細胞の数nは、低酸素症が組織に誘導されているかどうかを判定するために使用することができる。この方法は、胚性網膜幹細胞ニッチにおける増殖が低酸素症の誘発時に減少することを示す以前に発表された結果13に基づいている。したがって、本発明者らは、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）を胚培地に添加し、新たに増殖する細胞のDNAへの取り込みを測定することによって、網膜幹細胞増殖のレベルをモニターした。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、カエルやゼブラフィッシュの胚に使用するために調整された低酸素を誘発する簡単ではあるが堅牢な新しい方法を紹介しましたが、他の水生生物にも適しています。この方法の大きな利点は、その単純さとコスト効率にあります。それにもかかわらず、この方法で達成される結果は非常に頑強である。本発明者らは、全胚および特定の組織（ここでは網膜）において、低酸素がチ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業はウェルカム・トラストSIA賞100329 / Z / 12 / ZからWAHへの支援とHKに授与されたDFGフェローシップKH 376 / 1-1
Materials
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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