Differenziare i condrociti da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo derivato dal sangue
Summary
Presentiamo un protocollo per generare una linea condrogenica dal sangue periferico umano (PB) attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) utilizzando un metodo senza integrazione, che comprende la formazione del corpo embrionale (EB), l'espansione delle cellule fibroblasiche e l'induzione condrogenica.
Abstract
In questo studio abbiamo utilizzato le cellule del sangue periferico (PBCs) come cellule di sementi per produrre condrociti attraverso cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) in un metodo senza integrazione. A seguito della formazione del corpo embrionale (EB) e dell'espansione cellulare fibroblastica, iPSCs sono indotti per la differenziazione condrogenica per 21 giorni in condizioni prive di siero e privo di xeno. Dopo l'induzione di condrociti, i fenotipi delle cellule sono valutati mediante analisi morfologiche, immunohistochemiche e biochimiche, nonché con l'esame quantitativo in tempo reale PCR di marcatori di differenziazione condrogenica. I pellet condondensivi mostrano una colorazione blu positiva e blu toluidina. L'immunohistochemistry della colorazione dei collagene II e X è anche positivo. Il contenuto di glicosaminoglicano solfato (sGAG) ei marcatori di differenziazione condrogenici COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 e AGGRECAN sono notevolmente aumentati nella condizionePellicole rogeniche rispetto a hiPSC e cellule fibroblastiche. Questi risultati suggeriscono che i PBC possono essere utilizzati come cellule di sementi per generare iPSC per la riparazione della cartilagine, che è specifica del paziente e conveniente.
Introduction
Il tessuto cartilagineo ha una capacità molto scarsa per l'auto-riparazione e la rigenerazione. Sono stati utilizzati diversi interventi chirurgici e trattamenti biologici per ripristinare la funzionalità della cartilagine e delle articolazioni, con risultati insoddisfacenti. Il recente sviluppo della tecnologia delle cellule staminali può cambiare l'intero campo di riparazione della cartilagine 1 . Diverse cellule staminali sono state studiate come cellule di sementi, ma le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hiPSCs) sembrano essere la scelta più promettente in quanto possono fornire molti tipi di cellule specifiche del paziente senza causare reazioni di reiezione 2 . Inoltre, possono superare la limitata natura proliferativa delle cellule adulte e mantenere le proprie capacità di auto-rinnovamento e pluripotenti. Inoltre, il targeting genico può essere utilizzato per cambiare il genotipo per ottenere tipi specifici di condrociti.
I fibroblasti sono stati ampiamente usati per generare iPSC perché i loro potenziamenti di riprogrammazione sono stati anche studiati bene.Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni che devono essere superate, come la dolorosa biopsia dei pazienti e la necessità di espansione in vitro dei fibroblasti, che possono portare a mutazioni genetiche 3 . Recentemente, i PBC sono stati trovati vantaggiosi per la riprogrammazione 4 ; Inoltre, sono stati comunemente utilizzati e abbondantemente memorizzati. È possibile che possano reindirizzare la messa a fuoco dello studio dalla pelle. Tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze, ci sono poche relazioni sulla riprogrammazione del PBC seguito dalla differenziazione nei condrociti.
Nello studio in corso, utilizziamo PBC come fonte alternativa riprogrammandoli in iPSC e poi differenziando iPSC nel linfondaggio genetico attraverso un sistema di coltura di pellet per imitare la formazione di condrociti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui forniamo un protocollo per generare condrociti da PBC tramite iPSC. Poiché i PBC sono più comuni e ampiamente utilizzati nel campo clinico, essi vengono presentati come una potenziale alternativa per la riprogrammazione. In questo studio, visi episomici (EV) sono stati utilizzati per riprogrammare PBC in iPSC, seguendo il metodo stabilito da Zhang et al. 11 . Questo approccio senza integrazione non prevede l'integrazione di genotossicità associata a virus, che si ritiene avere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vogliono ringraziare Xiaobin Zhang per il suo plasmide. Ringraziamo anche Shaorong Gao e Qianfei Wang per il loro aiuto gentile durante l'esperimento. Questo studio è sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (No.81101346, 81271963, 81100331), dal progetto di talento di Pechino 215 ad alto livello (No.2014-3-025) e dal Fondo Chao-Yang Hospital di Pechino (No CYXX-2017-01) e l'Associazione per la promozione dell'innovazione giovanile dell'Accademia delle Scienze Cinesi (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
