Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
Summary
Мы представляем протокол для получения хондрогенной линии из периферической крови человека (PB) через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) с использованием метода без интеграции, который включает образование эмбриоидного тела (EB), расширение фибробластических клеток и хондрогенную индукцию.
Abstract
В этом исследовании мы использовали клетки периферической крови (PBC) в качестве семенных клеток для получения хондроцитов через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в методе без интеграции. После образования эмбриоидного тела (EB) и расширения фибробластических клеток iPSCs индуцируются для хондрогенной дифференцировки в течение 21 дня в условиях без сыворотки и без ксенонов. После индукции хондроцитов фенотипы клеток оценивают с помощью морфологических, иммуногистохимических и биохимических анализов, а также путем количественного анализа ПЦР в реальном времени маркеров хондрогенной дифференцировки. Хондрогенные гранулы показывают положительное синее голубое и толуидиновое окрашивание синим. Иммуногистохимия окрашивания коллагена II и X также положительна. Содержание сульфатированного гликозаминогликана (sGAG) и маркеры хондрогенной дифференцировки COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 и AGGRECAN значительно повышены в хондРогенных гранул по сравнению с hiPSCs и фибробластическими клетками. Эти результаты показывают, что PBC могут использоваться в качестве семенных клеток для создания iPSC для восстановления хряща, который является специфичным для пациента и экономически эффективным.
Introduction
Хрящевая ткань обладает очень низкой способностью к самовосстановлению и регенерации. Различные хирургические вмешательства и биологические методы лечения используются для восстановления функции хряща и суставов с неудовлетворительными результатами. Недавняя разработка технологии стволовых клеток может изменить всю область восстановления хряща 1 . Различные стволовые клетки изучались как семенные клетки, но человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), по-видимому, являются наиболее перспективным выбором, поскольку они могут обеспечить многие типы специфичных для пациента клеток, не вызывая реакции отторжения 2 . Кроме того, они могут преодолеть ограниченную пролиферативную природу взрослых клеток и сохранить свои способности к самообновлению и плюрипотентности. Более того, генный нацеливание может использоваться для изменения генотипа для получения конкретных типов хондроцитов.
Фибробласты широко используются для создания iPSC, потому что их перепрограммирующие потенциалы также хорошо изучены.Тем не менее, все еще есть некоторые ограничения, которые необходимо преодолеть, такие как болезненная биопсия у пациентов и необходимость расширения фибробластов in vitro , что может привести к мутациям гена 3 . Недавно было обнаружено, что PBCs выгодны для перепрограммирования 4 ; Кроме того, они обычно использовались и содержались в большом количестве. Возможно, они могут перенаправить фокус исследования с кожи. Однако, насколько нам известно, имеется несколько сообщений о перепрограммировании PBC с последующей дифференциацией на хондроциты.
В текущем исследовании мы используем PBC как альтернативный источник, перепрограммируя их в iPSC, а затем дифференцируя iPSCs в хондрогенную линию через систему культивирования гранул, чтобы имитировать образование хондроцитов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы предоставляем протокол для получения хондроцитов из PBC через iPSC. Поскольку ПБС более распространены и широко используются в клинической области, они представлены в качестве потенциальной альтернативы для перепрограммирования. В этом исследовании эписомальные векторы (EV) исп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Xiaobin Zhang за его плазмиду. Мы также благодарим Шаоронг Гао и Цяньфэй Ван за их любезную помощь во время эксперимента. Это исследование поддерживается Национальным фондом естественных наук Китая (№ 81101346, 81271963, 81100331), проектом талантов высокого уровня в Пекине-215 (№ 2014-3-025) и Фондом больниц Пекин-Чао-Янь (нет CYXX-2017-01) и Ассоциацией содействия инновациям молодежи Китайской академии наук (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
References
- Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
- Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
- Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
- Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
- Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5′-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
- Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
- Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
- Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
- Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
- Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
- Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
- Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
- Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).
