말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화
Summary
우리는 배아 체 형성 (EB) 형성, 섬유 아세포 세포 확장 및 연골 형성 유도를 포함하는 통합없는 방법을 사용하여 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 인간 말초 혈액 (PB)으로부터 연골 세포 계통을 생성하는 프로토콜을 제시한다.
Abstract
이 연구에서, 우리는 말초 혈액 세포 (PBCs)를 통합 된 방법으로 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)를 통해 연골 세포를 생산하는 종자 세포로 사용했다. 배아 체 형성 (EB) 형성 및 섬유 아세포 세포 확장 후, iPSCs는 무 혈청 및 이종없는 조건 하에서 21 일 동안 연골 분화 유도된다. 연골 세포 유도 후 형태 학적, 면역 조직 화학적 분석 및 생화학 적 분석뿐만 아니라 연골 분화 마커의 정량적 실시간 PCR 검사를 통해 세포의 표현형을 평가한다. 연골 형성 펠릿은 알 시스 파랑 및 톨루이딘 블루 염색 양성 반응을 보였다. 콜라겐 II와 X 염색의 면역 조직 화학도 양성이다. 황화 글리코 사 미노 글 라이칸 (sGAG) 함량과 연골 분화 마커 인 콜라겐 2 ( COL2 ), 콜라겐 10 ( COL10 ), SOX9 및 아그로 칸 (AGGRECAN)hiPSCs 및 섬유 아세포와 비교하여 rogenic pellets. 이러한 결과는 PBC가 연골 수복을위한 iPSC를 생성하기위한 종자 세포로 사용될 수 있음을 시사한다.
Introduction
연골 조직은자가 수복 및 재생 능력이 매우 낮습니다. 다양한 외과 적 중재 및 생물학적 치료법이 연골 및 관절 기능을 회복시키는 데 사용되고 있으며 만족스럽지 못한 결과가 있습니다. 최근 줄기 세포 기술의 발달로 전체 연골 치료 분야가 바뀔 수 있습니다 1 . 다양한 줄기 세포가 종자 세포로 연구되었지만 인간 유도 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 거부 반응을 일으키지 않으면 서 여러 유형의 환자 특정 세포를 제공 할 수 있기 때문에 가장 유망한 선택 인 것으로 보인다 2 . 또한, 그들은 성체 세포의 제한된 증식 성을 극복하고 자신의 재생 능력과 만능 능력을 유지할 수 있습니다. 또한, 유전자 표적화는 연골 세포의 특정 유형을 얻기 위해 유전자형을 변경하는 데 사용할 수 있습니다.
섬유 아세포는 재 프로그래밍 잠재력이 잘 연구 되었기 때문에 iPSC 생성에 널리 사용되었습니다.그러나 환자의 고통스런 생검 및 섬유 아세포의 시험 관내 팽창에 대한 필요성과 같이 유전자 돌연변이를 야기 할 수있는 몇 가지 한계가 아직 극복되어야합니다 3 . 최근, PBC는 리 프로그래밍 4에 유리한 것으로 나타 났으며; 게다가, 그들은 일반적으로 활용되었고 풍부하게 저장되었다. 연구 초점을 피부에서 방향을 바꿀 수도 있습니다. 그러나 우리가 아는 바로는 PBC 재 프로그램과 연골 세포로의 분화에 관한보고는 거의 없습니다.
현재 연구에서 우리는 연골 세포 형성을 모방하기 위해 pellet 배양 시스템을 통해 iPSCs를 연골 세포 계통으로 분화시킨 다음 iPSCs로 분화시켜 PBCs를 대체 소스로 이용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 iPSCs를 통해 PBCs에서 연골 세포를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. PBC는 임상 분야에서 보편적으로 널리 사용되기 때문에 재 프로그래밍을위한 잠재적 대안으로 제시됩니다. 이 연구에서, episomal vectors (EV)는 Zhang et al.에 의해 확립 된 방법에 따라 PBC를 iPSC로 재 프로그램하기 위해 이용되었다 . 11 . 이러한 통합이없는 접근 방식은 임상 필드 <sup class="xr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 자신의 플라스미드 인 Xiaobin Zhang에게 감사 드리고자합니다. 우리는 또한 Shaorong Gao와 Qianfei Wang에게 실험 중에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (No.81101346, 81271963, 81100331), 베이징 215 고급 인재 프로젝트 (No.2014-3-025) 및 베이징 차오양 병원 기금 (No CYXX-2017-01), 중국 과학 아카데미 청소년 혁신 진흥 협회 (YL).
Materials
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829018 | Basal medium used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Invitrogen | 10828028 | A more defined, FBS-free medium supplement used for hiPSC culture and EB formation medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | sh30070.03 | Used for hiPSC culture and EB formation medium,offers excellent value for cell culture |
| Nonessential amino acids | Chemicon | TMS-001-C | Used as a growth supplement in all the cell culture medium, to increase cell growth and viability |
| L-glutamine | Invitrogen | 35050061 | An amino acid required for cell culture |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B | A cytokine used for sustaining the pluripotency and self-renewal of hiPSCs |
| Dispase | Invitrogen | 17105041 | Used for hiPSC dissociation for subculture |
| DMEM | Gibco | C11960 | Basal medium used for MSC culture medium |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | Used for cell attachment onto the dishes |
| 0.25% trypsin/EDTA | Gibco | 25200072 | Used for cell dissociation |
| DPBS | Gibco | 14190250 | A balanced salt solution used for cell wash or reagent preparing |
| β-mercaptoethanol | invitrogen | 21985023 | Used as a growth supplement in all the cell culture medium. |
| ITS | invitrogen | 41400045 | Insulin, Transferrin, Selenium Solution.Used for chondrogenic differentiation. |
| Ascorbic acid | Sigma | 4403 | Known as vitamin C. It helps in active growth and has antioxidant property. |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | Added to cell culture medium as an energy source in addition to glucose. |
| Transforming growth factor-beta 1 | Peprotech | AF-100-21C | A cytokine that regulate cell proliferation, growth and chondrogenic differentiation. |
| Rabbit polyclonal antibodies against Collagen II | Abcam | ab34712 | This antibody reacts with Type II collagens,which is specific for cartilaginous tissues. |
| Mouse monoclonal antibodies to Collagen X | Abcam | ab49945 | This antibody reacts with Type X collagen,which is a product of hyperthrophic chondrotocytes. |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | For mounting and long-term storage of slides |
| Toluidine blue | Sigma | 89640 | Used for proteoglycans detection. |
| Alcian blue | Amresco | #0298 | Used for glucosaminoglycans detection. |
| Papain | Sigma | P4762-25MG | Used to digest chondrogenic pellets. |
| Dimethylmethylene blue | Sigma | 341088-1G | Used to quantitate glycosaminoglyans |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-250MG | Used to draw the standard curve for sGAG content measurement. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 (100) | Used to determine DNA content |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | Used for RNA isolation from cells |
| Reverse Transcriptase System | Promega | A3500 | Used to convert RNA into cDNA |
| SYBR FAST qPCR kit Master Mix | Kapa | KK4601 | Used for Real-time PCR |
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