Summary
여기, 우리는 생쥐에서 생존 가능한 심실 슬라이스의 준비와 날카로운 전극 활동 전위 녹음에 대한 그들의 사용을 설명합니다. 이러한 다세포 제제는 생체 내 에서 생리 학적 및 약리학 적 연구 에 유용한 모델이되는 조직 구조와 같은 생체 내 보존성을 제공합니다.
Abstract
Murine 심근 세포는 심장 생리학 및 새로운 치료 전략에 대한 시험 관내 연구에 광범위하게 사용되었습니다. 그러나, 해리 된 심근 세포의 다세포 제제는 심장의 기계적 및 전기 생리 학적 성질에 영향을 미치는 심근 세포, 비 - 근세포 및 세포 외 기질의 생체 내 구조의 복합체 를 대표하지 못한다. 여기서 우리 는 생체 내 조직 구조와 같은 보존 된 생쥐 심근의 실용적 심실 슬라이스를 준비하고 전기 생리 학적 기록에 대한 적합성을 입증하는 기술을 설명합니다. 심장 절제 후 심실을 심방에서 분리하고 2,3-butanedione monoxime이 포함 된 Ca 2+가 없는 용액으로 관류하고 4 % 저 용융 아가로 오스 블록에 묻힌다. 블록을 진동 날이있는 마이크로톰 위에 놓고 150-400 μm 두께의 조직 절편을 준비하여 진동을 유지합니다. fre블레이드를 가능한 한 천천히 앞으로 움직이게합니다. 조각의 두께는 추가 응용 프로그램에 따라 다릅니다. 슬라이스는 0.9 mM Ca 2+ 및 2,3- 부탄 다이옥신 모노 옥심 (BDM)을 함유 한 차가운 타이로드 용액에 30 분 동안 저장한다. 그 후, 슬라이스를 37 ℃의 DMEM으로 옮겨 30 분간 BDM을 세척한다. 조각은 수축 기능을 분석하거나 이식 된 줄기 세포 유래 심근 세포와 숙주 조직의 상호 작용을 조사하기 위해 힘 측정을 위해 날카로운 전극 또는 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구에 사용할 수 있습니다. 날카로운 전극 녹음을 위해, 슬라이스는 거꾸로 현미경의 가열 판에 3cm 세포 배양 접시에 배치됩니다. 슬라이스는 단 극성 전극으로 자극되고 슬라이스 내의 심근 세포의 세포 내 활동 전위는 날카로운 유리 전극으로 기록됩니다.
Introduction
얇은 조직 조각은 Yaman과 Mcllwain이 1966 년에 뇌 조각의 전기적 활동이 시험 관내에서 유지 된다는 것을 보여주기 때문에 기초 과학에서 자주 사용되었습니다 1 . 그 이후로 뇌 2 , 간 3 , 폐 4 및 심근 조직 5 , 6 , 7의 조각에 대해 전기 생리 학적 및 약리학 적 연구가 수행되었습니다. 신생아 쥐의 심실 조각에서 첫 번째 패치 - 클램프 녹음은 1990 년 8 월 에 기술되었지만,이 기술은 오랫동안 망각에 빠졌다. 10 년이 지난 후에, 우리 그룹은 쥐 배아 9 , 신생아 10 및 성인 11 심장 조각을 준비하는 새로운 방법을 확립했습니다. 이러한 생존 가능한 조직 절편은 급성 실험 (성인 슬라이스몇 시간 동안 배양 할 수 있음) 또는 단기 배양 실험 (배아 및 신생아 슬라이스를 며칠 동안 재배 할 수 있음). 전기 생리학적인 특성과 날카로운 전극 활동 전위 및 미세 전극 배열 녹음 11 에 의해 평가 된 동질적인 자극 확산과 같은 생체 내 슬라이스가 표시 됩니다 . "2 차원"형태로 인해 심전도의 모든 영역에 녹음 전극을 직접 액세스 할 수 있기 때문에 전기 생리 학적 연구를위한 흥미로운 도구가되며 Langendorff- 관류 심장 전체에 비해 새로운 실험 옵션이 제공됩니다. 베라파밀 (L-type Ca 2+ -channel blocker), 리도카인 (Na + 채널 차단제), 4- 아미노 피리딘 (비 선택적 전압 의존성 K + 채널 차단제) 및 리노피딘 (KCNQ K)과 같은 이온 채널 차단제에 대한 상기 약물의 약물 반응은, + 채널 차단기) 9 , 11 시험 관내 조직 모델로서 적합 함을 입증했다. 또한, 심전도 기록과 결합 된 수축 심실의 심실 슬라이스는 전기 및 기계적 통합뿐만 아니라 이식 된 태아 12 , 13 , 14 및 줄기 세포에서 파생 된 15 개의 심근 세포의 성숙을 특성화하는 데 매우 유용한 도구임이 입증되었습니다.
요약하면, 심실 슬라이스는 귀중하고 잘 확립 된 다세포 조직 모델이며 해리 된 심근 세포와 Langendorff- 관류 된 심장을 보완하는 것으로 간주되어야합니다심장 혈관 연구에서 심장 내 모든 부위에 예리한 전극 기록과 같은 측정 기술의 직접 액세스뿐만 아니라 생체 내 조직 구조 (해리 된 세포와 대조적으로)를 제공한다는 큰 이점이 있습니다 (전체 심장 조제와는 대조적으로).
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Protocol
동물 취급은 지역 동물 복지위원회의 지침과 유럽 의회의 2010 / 63 / EU 지침에 부합해야합니다.
1. 솔루션 준비
- NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코오스 10, HEPES 5, 2,3- 부탄 디온 모노 옥심 (BDM) 30. pH를 7.4로 조절하여 Ca 2+ (mM 조성)없이 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ℃에서 NaOH로 처리 하였다.
- NaCl 136, KCl 5.4, NaH 2 PO 4 0.33, MgCl 2 1, 글루코스 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl 2 0.9를 사용하여 Tyrode 용액을 준비한다. 4 ° C에서 NaOH로 pH를 7.4로 조절한다.
- 4 % 저 용융 아가로 오스 준비 : Ca 2+가 없는 15 mL Tyrode 용액에 0.6 g 저 용융 아가로 오스를 넣으십시오. agarose가 녹을 때까지 10-15 초 동안 750W에서 전자 레인지에서 2 번 혼합물을 가열한다. 용액을 37 ° C의 일정 온도로 유지하십시오.# 176; C를 연속적으로 저어 준다.
- 37 ℃에서 혈청없는 Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)을 carbogen (5 % CO2, 95 % O2)로 버블 링하십시오.
2. 마이크로톰을 준비하십시오.
- 마이크로톰을 켜십시오.
- 외부 마이크로톰 챔버를 얼음으로 채 웁니다.
- 내부 마이크로톰 챔버를 Ca 2+가 없는 얼음 차가운 Tyrode 용액으로 채우고 100 % O 2 로 계속해서 용액에 산소를 공급하십시오.
- Microtome의 블레이드 홀더에 스틸 블레이드를 놓습니다.
3. 마우스 심장 격리
- 피하에 2,500 U 헤파린 주입. 15 분간 기다리십시오.
- 자궁 경관 탈구로 동물을 희생.
- 흉골 절개로 가슴을 엽니 다.
- 조심스럽게 작은 가위와 집게 # 5를 사용하여 심낭을 절개하십시오.
- 상행 대동맥에 캐뉼라를 삽입하고 관상 동맥을 얼음으로 차가운 Tyrode 's로 관류시킵니다용액을 남은 혈액이 제거 될 때까지 제거한다.
- 부드럽게 포셉과 가위로 심장을 절제하고 차가운 Tyrode의 용액을 Ca 2+ 없이 흘려 보내십시오.
- 메스와 가위로 심방과 심방을 분리하십시오.
4. 4 % 저 융점 아가로 오스에 심실 내장
- 정점이있는 심실을 아가로 오스 몰드 ( 그림 1 )에 위쪽으로 향하게하십시오. 좌심실의 금형 중앙에 핀을 놓습니다.
- 심장이 완전히 덮일 때까지 37 ° C에서 4 % 저 용융 아가로 오스로 곰팡이를 채 웁니다.
- 금형을 얼음에 담그면 아가로 오스가 빨리 경화되어 뜨는 것을 방지 할 수 있습니다.
- 메스와 함께 금형에서 심실이 들어있는 아가로 오스 블록을 제거합니다.
- 블록을 거꾸로 뒤집고 심실을 채우고 아가로 오스 블록의 뒷면에있는 간격을 채우십시오.s는 20G 바늘이 달린 주사기를 사용하여 4 % 저 용융 아가로 오스가있는 털갈이의 핀으로 남겨 두었습니다.
- 메스로 아가로 오스 블록을 자르면 블록의 평평한 바닥과 심장 정점의 직립 위치를 얻을 수 있습니다.
5. 심실 조직 절개
- cyanoacrylate 접착제 한 방울로 microtome의 표본 홀더에 블록을 고정하십시오. 심장 정점을 위로 향하게하십시오.
- 표본 홀더를 칼슘 2가 없는 얼음처럼 차가운 Tyrode로 채워진 마이크로톰의 내부 표본 챔버에 놓습니다. Tyrode의 솔루션으로 아가로 오스 블록을 완전히 덮으십시오.
- 추가 응용 프로그램 (날카로운 전극 녹음 150-200 μm의)에 따라 150-400 μm의 두께로 짧은 축 슬라이스를 준비하고 블레이드의 진동 주파수를 60-70 Hz로 유지하고 가능한 한 천천히 블레이드를 앞으로 이동시킵니다 .
- 작은 브러시를 사용하여 슬라이스에서 남아있는 아가로 오스를 조심스럽게 제거하십시오.
- 부드럽게 전송0.9 % 칼슘 2 + 100 % O 2 와 함께 Tyrode의 솔루션에 파스퇴르 피펫으로 슬라이스 슬라이스 절차에서 회복하기 위해 얼음에 최소한 30 분 동안 그들을 저장합니다.
- 그 후 37 ℃에서 DMEM으로 30 분간 슬라이스를 유지하고 카보 겐이 폭기되어 BDM을 더 잘 사용하기 전에 씻어 낸다.
6. 샤프 전극 준비 준비
- 예열의 경우 녹음이 시작되기 30 분 전 모든 전기 장치를 켜십시오.
- 거꾸로 현미경에 배치 가열 플레이트에 3cm 세포 배양 접시를 넣어.
- 접시에 맞춤형 링 전극 ( 그림 2 )을 놓고 전치 증폭기와 자극 전극의 접지선을 연결하십시오.
- 관류 시스템의 유연한 튜브를 접시에 연결하십시오.
- carbogen으로 폭기 DMEM와 재관류 시스템의 저수지를 입력하십시오.
- 관류 펌프를 켜고 관류를 설정하십시오2 ~ 3 mL / min.
- 유량 히터와 가열 플레이트를 조절하여 37 접시에 DMEM의 온도를 조정합니다.
7. 활동 잠재 녹음
- DMEM 가득 접시에 심실 슬라이스를 놓습니다.
- 거꾸로 된 현미경으로 조직의 구조적 무결성과 생존력 (수축 기능에 기반)을 확인하십시오.
- 기록 용 유리 전극을 3M KCL로 채 웁니다.
- DMEM으로 자극 전극을 채 웁니다.
- 녹음 전극과 자극 전극을 전극 홀더에 놓습니다.
- 슬라이스에 자극 전극을 조심스럽게 넣고 전기 자극기를 켭니다. 1-2 Hz의 자극 주파수로 시작하십시오.
- micromanipulator와 함께 기록 전극을 의도 된 기록 위치로 이동시킵니다.
- 팁이 조직에 닿을 때까지 녹음 전극을 천천히 내립니다.
- 짧은 직사각형 전기 펄스를기록 전극은 세포막을 관통한다.
- 안정된 신호가 확보 될 때까지 기록 전극의 위치를 조심스럽게 바꾸십시오.
- 활동 잠재력의 기록을 시작하십시오.
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Representative Results
심근 경색은 심근 세포의 사실상 비가 역적 손실을 초래합니다. 줄기 세포 유래의 심근 세포를 외인성 심장 재생에 사용하는 세포 대체 요법이 유망한 치료법이다. 이식 된 세포의 전기적 통합과 성숙은 세포 대체 요법의 안전성과 효율성을 위해 매우 중요합니다.
통합 및 성숙을 평가하기 위해 우리는 성숙한 생쥐의 건강한 심장에 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP)을 발현하는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCM, 0.5 x 106 iPSCM / 10 μL 2 회 주사)에서 유래 한 심근 세포를 이식했다. (Peinkofer et al. 방법에 대한 자세한 설명은 15 )을 참조하십시오. 이식 6 일 후에, 수혜자 심장의 심실 조각을 기술 된 프로토콜을 사용하여 준비 하였다. 대표적인 녹음은그림 3. 이식 된 iPSCM이 포함 된 슬라이스를 37 ° C에서 DMEM에 넣고 숙주 조직에 위치한 단극 전극 ( 그림 3A , 왼쪽)으로 국소 적으로 자극했습니다. 세포 내 활동 전위는 eGFP 양성 이식 된 iPSCM 및 슬라이스 내의 인접한 숙주 조직에서 3M KCl로 채워진 날카로운 유리 미세 전극으로 기록 하였다 ( 도 3A , 우측).
수용자의 심장에 이식 된 iPSCM의 지속성 및 전기적 통합을 입증 할 수 있습니다. iPSCM은 이식 된 심근 세포에서 세포 내로 기록 된 자극성 인공물과 활동 전위의 시간 상호 의존성이 존재한다면 전기적으로 통합 된 것으로 간주되었다 ( 그림 3B ). 전기적 통합의 품질은 전기적 활성화의 지연, 즉 자극과 시작 사이의 지연에 의해 정량화 될 수있다운동 전위 상승, 전도 차단이없는 최대 자극 주파수, 즉 모든 자극 후 1 : 1 세대의 활동 전위를 유도하는 최대 자극 빈도.
이 대표적인 실험에서 이식 된 iPSCM은 약 5Hz의 전도 블록이없는 최대 자극 주파수 ( 그림 3B , 오른쪽)에 표시된 바와 같이 전기적으로 통합되었지만 커플 링의 품질은 호스트 조직 내에서보다 길게 자극 인공물과 활동 전위 상향 조절 사이의 지연 (숙주 조직 : 8 ms, iPSCM : 20 ms). 숙주 심근 세포의 활동 전위는 84 mV 진폭, -74 mV 최대 확장기 잠재력, 50 % 재분극시 11 ms 지속 시간, 90 % 재분극시 108 ms 지속 시간 및 114 V / s 상승 스트로크를 보였다. 자극 주파수를 1에서 5 Hz로 증가 시키면 활동 전위가 감소합니다.90 % 재분극시 이온 (86 ms). 이식 된 iPSCM은 활동 전위 특성에 상당한 차이를 보였다. 숙주 세포와 비교하여 진폭은 더 작았으며 (53mV), 최대 이완기 잠재력은 마이너스 (-54mV), 50 % 재 극성 증가 기간 (14ms), 90 % 재분극 기간이 더 짧음 (90ms) 및 상향 행정 속도 느린 (57 V / s). 자극 주파수가 1에서 5 Hz로 증가하면 90 % 재분극 (67 ms)에서 활동 전위 지속 시간이 감소합니다. 결론적으로, 이식 6 일 후의 대표적인 예에서, 분석 된 iPSCM은 미성숙 한 심근 세포의 전형적인 특징을 나타냈다. 이 일화 적 발견은 통계적으로 충분한 수의 세포 및 조제 물에서의 측정과 일치하며, 이는 15 세 이전에보고 된 것이다.
그림 1 : 아가로 오스에 심지를 삽입하기위한 맞춤형 금형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 샤프 전극 레코딩을위한 맞춤형 링 전극 (접지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 이식 된 iPSCM의 전기적 통합 . ( A ) eGFP 양성 iPSCM을 포함하는 심실 심장 절편 (왼쪽) (오른쪽). SE :자극 전극. 빨간색 점은 녹음 위치를 표시합니다. ( B ) 건강한 숙주 조직 (상부 궤적) 및 이식 된 iPSCM (하부 궤적)에서의 활동 잠재력 기록. 슬라이스는 약 2Hz (좌측 트레이스) 및 5Hz (우측 트레이스)에서 숙주 조직에 위치한 자극 전극으로 국소 적으로 자극되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심실 슬라이스는 조직 구조와 같은 생체 내에서 보존되고 심장의 모든 부위에 측정 기술을 직접 액세스 할 수있는 전기 생리 학적, 약리학 적 및 기계적 연구를 가능하게합니다. 생리 작용 잠재 성질은 배아, 신생아 및 성인 조각 9 , 10 , 11 에서 입증되었습니다. 슬라이싱 절차에 의해 직접적으로 손상된 표면층을 제외한 슬라이스의 활력은 활력 염색으로 확인되었습니다 9 . 날카로운 유리 전극을 사용하는 조각 내에서의 활동 전위 기록은 여기에 설명 된 이식 된 심근 세포의 통합 및 성숙을 조사하거나 심장 활성 화합물을 첨가 한 후 약리학 연구에 사용할 수 있습니다. 개별 셀에서 1 시간 이상 지속되는 장기간 녹음이 가능합니다. 이 녹음 시간은 테스트하기에 충분합니다.순차적 재관류 및 세척에 의한 하나의 세포에 대한 상이한 약리학 적 화합물의 영향.
중요한 준비 단계
슬라이스의 품질을 최적화하려면 허혈성 조직 손상을 피해야합니다. 따라서 Tyrode의 해결책으로 심장의 원위치 관류, 빠른 심장 절제술 및 얼음 냉증 산소가 공급 된 Tyrode 용액에서의 즉각적인 보존이 중요합니다. 2,3-butanedione monoxime을 사용하여 박동하는 심장을 고정화하면 허혈에 대한 감수성이 더욱 감소 할 수 있으며 저 용융 아가로 오스에 고체를 묻히는 데 필요합니다. 저 용융 아가로 오스에 끼워 넣는 것은 확산을 제한하여 조직 공급을 방해하지만 슬라이스하기 전에 부드러운 심장 조직을 안정화시키는 데 필수적입니다. 시편 블록 내의 작은 구멍, 예를 들어 아가로 오스 또는 잔류 기포가 완전히 채워지지 않은 심실이 조직 안정화를 방해 할 수 있습니다. 불안정한 심근 조직은 충분한 resis를 제공하지 못함심한 조직 손상과 손상을 유발하는 진동 날에 맞 춥니 다. 명확한 컷을 보장하고 조직 손상을 최소화하려면 블레이드를 날카롭게해야합니다 ( 예 : 3 회 이상 재사용하지 않음). 표본 블록을 통과하는 블레이드의 전방 이동은 가능한 한 느려야합니다. 둔한 블레이드 또는 과속이 내장 된 심실이 있거나 조직을 열등하게합니다.
신뢰할 수 있고 재현성있는 결과를 보장하기 위해 슬라이스의 품질은 현미경으로 확인할 수있는 조직의 구조적 무결성 및 최대 10 Hz의 생리 학적 타격 주파수에서 전기 자극에 대한 반응을 포함한 특정 기준을 충족해야합니다.
추가 적용에 따라 슬라이스를 150-400 μm의 두께로 절단 할 수 있습니다. 얇은 조각은 조직 코어의 저산소 상태를 예방하고 형광 현미경으로 이식 된 세포를보다 쉽게 검출 할 수있을뿐만 아니라기록 전극 ( 15)의 경우,보다 두꺼운 슬라이스가 조직 구조의보다 양호한 무결성 및 조직의보다 높은 안정성을 제공 할 수 있으며, 이것은 힘 측정 ( 10) 및 기록 후 추가의 조직 학적 처리에 유리할 것이다.
이온 채널 및 Ca 2+ 처리 단백질 16 , 17 에 대한 높은 BDM 농도의 잠재적 영향을 방지하기 위해 BDM 유리 DMEM에서 슬라이스를 30 분 이상 배양하여 BDM washout을 사용하기 전에 추가로 사용하는 것이 좋습니다. 놀랍게도, BDM 세척 후 조직의 수축 및 후속 운동은 날카로운 전극 기록을 방해하지 않습니다.
제한 사항
일반적인 세포 배양 모델과는 달리 슬라이스는 보존 된 전기적 및 기계적 세포와 세포 연결, 세포 외 기질과 심근의 분포를 포함한 손상되지 않은 조직 구조를 제공합니다Tes 및 비 - myocytes 6 . 그러나 인공 조직에 의해 공급되고 준비 과정에서 손상 될 수 있으므로 심장 조직 슬라이스는 생체 내 상황과 정확하게 일치하지 않습니다. Trypan blue 염색 및 활성 카스파 제 -3 및 PARP p85 단편의 면역 조직학 평가 결과, 표층에있는 것들을 제외하고 배아 슬라이스 내의 세포는 9 개의 슬라이스 후 생존 가능함이 밝혀졌다.
전도 시스템은 심실 슬라이스에 보존되지 않으며, 여기 확산은 플랫 슬라이스에서 3 차원이 아닌 2 차원입니다. 배아 심장에서 조각은 문화에 최대 2 주 동안 자발적인 박동을 보여줍니다 9 . 성인 조각의 자연 수축이 발생할 수도 있으며, 전도 시스템의 세포에 의해 유도되는지 또는 세포 손상 및 Ca 2+를 나타내는 지 여부는 불분명하다18 세 .
향후 응용 프로그램
날카로운 전극과 미세 전극 배열을 이용한 전기 생리 학적 연구 이외에도, 약리학 적 실험을 통해 약물의 활동 잠재력과 자극 확산에 미치는 영향을 분석 할 수 있으며, 발달 연구 19 또는 위에 제시된 이식 된 심근 세포 15 의 특성, 신생아의 심실 조각 성인 조각에도 적용 할 수있는 힘 수축 측정에 하트가 사용되었습니다. (I) 세포 간 커플 링을 연구하기 위해 gap junction permeable dyes를 주사하거나 내피 세포를 연구하는 등 (II) 주입 된 줄기 세포 유래 cardiomyocytes의 구조적 통합을 평가하는 것과 같은 재배 된 슬라이스의 장기 현미경 연구 코로나의 혈관 기능조각 내에서 선박.
결론적으로, 심실 슬라이스는 일반적인 세포 배양 모델의 한계를 극복하는 데 도움이되는 생체 내 구조 와 같은 보존 된 가치있는 다세포 조직 모델이며 다양한 약리학 적, 생리 학적 발달 및 세포 치료 연구에 적용 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 워크샵과 신경 생리학 연구소의 동물 시설에서 제공하는 지원을 인정합니다. 이 작업은 Walter und Marga Boll- Stiftung, Köln Fortune 및 Deutsche Stiftung für Herzforschung에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leica VT 1000s | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | Microtome with vibrating blade. | |
| Stainless Steel Blades | Campden Instruments, Loughborough, England | 7550-1-SS | |
| Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | Z627992 | |
| Fine brush, e.g. size 6 (4/32") | VWR, International, Radnor, USA | 149-2125 | |
| Preparation table | self made | ||
| Molt for embedding ventricles in agarose | self made | ||
| 1 mL Syringe | Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA | 300013 | |
| 27 G x 3/4`` Needles | Braun, Melsungen, Germany | 4657705 | |
| 20 G 11/2`` Needles | 4657519 | ||
| Small scissor | WPI, Sarasota, USA | 501263 | |
| Tweezers #5, 0.1 x 0.06 mm tip | WPI, Sarasota, USA | 500342 | |
| Oxygen gas (medical grade O2) | Linde, Munich, Germany | ||
| Carbogen gas (95 % O2, 5 % CO2) | Linde, Munich, Germany | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 7647-14-5 | |
| KCl | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746436 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 746495 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | NIST200B | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | 51558 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S5761 | |
| D(+)-Glucose | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | G8270 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | M7506 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich, St. Louise, USA | S8045 | |
| Cyanoacrylate glue | Henkel, Düsseldorf, Germany | ||
| Low-melt Agarose | Roth, Karlsruhe, Germany | 6351.2 | |
| Heparin-sodium-25000 I.E./5 mL | Ratiopharm, Ulm, Germany | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX | ThermoScientific, Waltham, USA | 10566016 | |
| SEC-10LX Amplifier | npi electronic GmbH, Tamm, Germany | SEC-10LX | |
| EPC 9 | HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germany | ||
| Zeiss Axiovert 200 | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
| Low magnification Micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | Nm-3 | |
| High magnification, three-axis micromanipulator | Narashige, Tokyo, Japan | MHW-3 | |
| Peristaltic perfusion pump | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | PPS2 | |
| 2-channel temperature controller | Multi Channel Systems, Reutlingen, Germany | TCO02 | |
| Square pulse stimulator | Natus Europe GmbH, Planegg, Germany | Grass SD9 | |
| Glass capillaries | WPI, Sarasota, USA | 1B150F-1 |
References
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