الجاذبة الإرواء كطريقة لتصور الأوعية الدموية في<em> أمبيستوما ميكسيكانوم</em
Summary
باستخدام محبة للدهون 1،1'- ديوكتاديسي -3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البركلورات (الجاذبة) تقنية تلطيخ، أمبيستوما ميكسيكانوم يمكن أن يخضع نضح الأوعية الدموية للسماح لتصور سهلة من الأوعية الدموية.
Abstract
وقد استخدمت تقنيات الإرواء لعدة قرون لتصور تداول الأنسجة. أكسولوتل (أمبيستوما ميكسيكانوم) هو نوع من السمندل الذي برز كنموذج أساسي لدراسات التجدد. لا يعرف إلا القليل عن كيفية إعادة التوعي يحدث في سياق التجدد في هذه الحيوانات. هنا نحن الإبلاغ عن طريقة بسيطة لتصور الأوعية الدموية في أكسولوتل عن طريق نضح من 1،1'-ديوكتاديسي 3،3،3 '، 3'-تيتراميثيليندوكاربوسيانين البيركلورات (الجاذبة). الجاذبة هو صبغ كاربوسيانين محبة للدهون التي تدرج في غشاء البلازما من الخلايا البطانية على الفور. يتم الإرواء باستخدام مضخة تحوي بحيث يدخل الجاذبة الدورة الدموية من خلال الشريان الأبهر. خلال نضح، وتدفق صبغ من خلال الأوعية الدموية أكسولوتل ودمجها في طبقة ثنائية الدهون من الخلايا البطانية الوعائية عند الاتصال. الإجراء نضح يستغرق حوالي ساعة واحدة لمدة 8 بوصة أكسولوتل. مباشرة بعد نضح وايث داي، و أكسولوتل يمكن تصور مع المجهر متحد البؤر الفلورسنت. ينبعث مؤشر الجاذب الضوئي الضوء في نطاق أحمر برتقالي عندما متحمس مع مرشح الفلورسنت الأخضر. هذا الإجراء نضح الجاذبة يمكن استخدامها لتصور بنية الأوعية الدموية من أكسولوتلس أو لإظهار أنماط إعادة التوعي في تجديد الأنسجة.
Introduction
تصور الأوعية الدموية يلعب دورا حيويا في فهم بنية ووظيفة الكائنات الحية عبر العديد من الأنواع. ابتداء من القرن ال 16 مع ليوناردو دا فينشي، وقد تم دراسة النماذج والرسوم البيانية من الدورة الدموية 1 . باستخدام الشمع والقوالب المطاطية، تم بيرفوسد الأنسجة لخلق نماذج ثلاثية الأبعاد من الأوعية الدموية، مما سمح لدراسة أورغانوجينيسيس والمرضية 1 ، 2 . تم تلوين الراتنجات والشمع مع الأصباغ مثل الهند الحبر أو القرمزي الأحمر للسماح لتصورها سهلة 1 ، 2 . ومع ذلك، تسببت هذه التقنيات العديد من القضايا لأن اللزوجة العالية منعت نضح كامل من الأنسجة من الفائدة 1 . كما أصبح الحقل أكثر تطورا، واستخدام المجاهر متحد البؤر والإلكترون دخلت حيز اللعب، ونقل تيشنيق نضح إيس بعيدا عن قوالب الزهر نحو بيرفوسيونس السائل من الأوعية الدموية، وبعضها سمح للنضح والتصوير من الأوعية الدموية دون تدمير الأنسجة الأولية 3 . دي، صبغ كاربوسيانين الفلورسنت، هو واحد من مثل وصمة عار الذي يسمح لنضح الحيوانات دون الأضرار التي لحقت أنسجة الأوعية الدموية.
الأصباغ كاربوسيانين هي الأصباغ محبة للدهون التي تدمج في أغشية الخلايا عند الاتصال. هذه الأصباغ تسمح لتلطيخ سهلة وحظية من الخلايا البطانية الوعائية، والتي يمكن بعد ذلك أن ينظر إليها تحت المجهر متحد البؤر الفلورسنت. تتحرك الجاذبة عن طريق الانتشار الجانبي في غشاء الدهون من الخلايا، كما هو مبين في وضع العلامات وتعقب الخلايا العصبية 4 . كيميائيا، وسلاسل ألكيل اثنين من الجاذبة تعطي الصبغة تقارب عالية لأغشية الخلايا، في حين أن اثنين من حلقات مترافق من فلوريوكروم الذي هو المسؤول عن انبعاث الطول الموجي الأحمر عندما متحمس من الفلورسنت الضوء الأخضر مرشحات> 4. وقد استخدمت الجاذبة في العديد من القدرات، بما في ذلك وضع العلامات الناجحة للغشاء البلازما وعلى حد سواء أنتيروغريد والوراء إلى الوراء في الخلايا العصبية 5 ، 6 . وقد استخدمت سابقا الجاذبة في بروتوكولات نضح في حين تصور الأوعية الدموية من الفئران 7 .
أكسولوتلس ( أمبيستوما ميكسيكانوم ) هي السلمندرات التي تعيش حصرا في البحيرات المالحة بالقرب من مكسيكو سيتي، المكسيك. وقد أصبحت هذه الحيوانات نموذجا هاما لفهم عمليات التجدد لأنها يمكن أن تجدد أطرافه الكاملة والذيل (بما في ذلك الحبل العصبي)، وأجزاء من القلب والأعضاء الداخلية الأخرى، وأجزاء من العين والبالغين 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، مع التطبيق الأخير من الأدوات الجينية في أكسولوتلس، نظرة غير مسبوقة في الجزيئات والخلايا التي تقود هذه العمليات من الممكن الآن 8 . نجاح ريجينالتموينية من طرف كامل يتطلب عملية إعادة التوعي واسعة النطاق، والتي قد تلعب دورا هاما في تجديد بعد مجرد الوظائف التقليدية للأوعية الدموية في توفير الأكسجين والمواد المغذية. فهم إعادة التوعي في سياق تجديد الأنسجة أمر حتمي. وقد سبق تصور الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام الهند الحبر، وبينما كانت النتائج مثيرة للاهتمام، لم يتم إعادة النظر في هذه العملية في العقود اللاحقة 10 . سعينا إلى تكييف بروتوكول نضح الجاذبة وضعت لاستخدامها في الثدييات للسماح لنضح كاملة والتصور من الأوعية الدموية أكسولوتل 7 . يصف هذا البروتوكول الخطوات التي اتخذت لإرواء بنجاح وبعد ذلك تصور الدورة الدموية أكسولوتل مع تقنية تلطيخ الجاذبة. هذا الإجراء سوف يسمح لتصور دقيق من الأوعية الدموية براءات الاختراع في الأنسجة التماثل، وكذلك في تجديد الأنسجة، ويوفر طريقة جديدة ل فيسواليزاتيون وتحليل عملية إعادة التوعي في أكسولوتل.
Protocol
Representative Results
Discussion
التصور من الأوعية الدموية من أكسولوتل يمكن أن يتحقق بنجاح عن طريق نضح مع صبغ كاربوسيانين محبة للدهون، الجاذبة. في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكول رواية لنضح من أكسولوتل مع الجاذبة باستخدام مضخة تحوي. وتبين لنا أيضا التصور اللاحق من الأوعية الدموية أكسولوتل باستخدام ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل مستشفى بريغهام والمرأة ومارس دايمس. ويود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر وايتيد على دعمهم ومشورتهم.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
