Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в<em> Разное</em
Summary
Используя липофильную методику окрашивания перхлоратом 1,1'-диоктадеци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин (DiI), Ambystoma mexicanum может подвергаться сосудистой перфузии, что позволяет легко визуализировать сосудистую систему.
Abstract
Методы перфузии использовались на протяжении веков для визуализации циркуляции тканей. Axolotl (Ambystoma mexicanum) – это вид саламандры, который стал важной моделью исследований регенерации. Мало что известно о том, как реваскуляризация возникает в контексте регенерации у этих животных. Здесь мы сообщаем простой способ визуализации сосудистой сети в аксолотле посредством перфузии перхлората 1,1'-диоктидаци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианина (DiI). DiI – липофильный карбоцианиновый краситель, который мгновенно встраивается в плазматическую мембрану эндотелиальных клеток. Перфузия осуществляется с использованием перистальтического насоса, так что DiI входит в циркуляцию через аорту. Во время перфузии краситель течет через кровеносные сосуды аксолотля и включается в липидный бислой сосудистых эндотелиальных клеток при контакте. Процедура перфузии занимает приблизительно один час для восьмидюймового аксолотля. Сразу после перфузии wiTh DiI, аксолотль можно визуализировать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. DiI излучает свет в красно-оранжевом диапазоне при возбуждении зеленым флуоресцентным фильтром. Эта процедура перфузии DiI может быть использована для визуализации сосудистой структуры аксолотлей или для демонстрации моделей реваскуляризации в регенерирующих тканях.
Introduction
Визуализация сосудистой сети играет важную роль в понимании структуры и функции организмов у многих видов. Изучены модели и графические представления об обращении с 16 -го века с Леонардо да Винчи 1 . Используя воски и резиновые формы, ткани были перфузированы для создания трехмерных моделей сосудистой сети, что позволило изучить органогенез и патогенез 1 , 2 . Смолы и воски окрашивались красителями , такими как индийские чернила или карминовые красные, чтобы обеспечить их легкую визуализацию 1 , 2 . Однако эти методы вызвали множество проблем, поскольку их высокая вязкость препятствовала полной перфузии интересующей ткани 1 . По мере того, как поле становилось все более изощренным, в него входило использование конфокальных и электронных микроскопов, перемещающих перфузионную технику От литейных форм и от жидких перфузий сосудистой сети, некоторые из которых допускают перфузию и визуализацию кровеносных сосудов без разрушения исходной ткани. 3 . DiI, флуоресцентный карбоцианиновый краситель, является одним из таких пятен, который позволяет перфузию животных без повреждения сосудистой ткани.
Карбоцианиновые красители представляют собой липофильные красители, которые вступают в клеточные мембраны при контакте. Эти красители позволяют легко и мгновенно окрашивать сосудистые эндотелиальные клетки, которые затем можно рассматривать под флуоресцентным конфокальным микроскопом. DiI движется через боковую диффузию в липидной мембране клеток, как показано в маркировке и отслеживании нейронов 4 . Химически две алкильные цепи DiI дают красителю его высокое сродство к клеточной мембране, тогда как два конъюгированных кольца из флуорохрома, который отвечает за излучение красной длины волны при возбуждении зелеными флуоресцентными светофильтрами> 4. DiI был использован во многих емкостях, включая успешную маркировку плазматической мембраны и антероградную и ретроградную маркировку в нейронах 5 , 6 . DiI ранее использовался в протоколах перфузии при визуализации сосудистой сети мышей 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) являются саламандрами, которые живут исключительно в солоноватых озерах вблизи Мехико, Мексика. Эти животные стали важной моделью для понимания процессов регенерации, поскольку они могут восстанавливать полные конечности, хвост (включая нервный шнур), части сердца и другие внутренние органы и части глаз, как взрослые 8 , 9 . Кроме того, с недавним применением генетических инструментов в аксолотлях стало возможным беспрецедентное проникновение в молекулы и клетки, управляющие этими процессами. Успешное возвращениеРадиус целой конечности требует обширного процесса реваскуляризации, который может играть значительную роль в регенерации за пределами просто традиционных функций кровеносных сосудов в обеспечении кислорода и питательных веществ. Понимание реваскуляризации в контексте регенерации тканей обязательно. Ранее сосуды Axolotl визуализировались с использованием индийских чернил, и хотя результаты были интригующими, этот процесс не был повторно рассмотрен в последующие десятилетия 10 . Мы стремились адаптировать протокол перфузии DiI, разработанный для использования у млекопитающих, чтобы обеспечить полную перфузию и визуализацию аксолотлевой сосудистой системы 7 . Этот протокол описывает шаги, предпринятые для успешной перфузии и последующего визуализации циркуляции аксолотля с использованием метода окрашивания DiI. Эта процедура позволит точно визуализировать патентные кровеносные сосуды в гомеостатических тканях, а также в регенерирующих тканях и обеспечивает новый метод визуализацииN и анализ процесса реваскуляризации в аксолотле.
Protocol
Representative Results
Discussion
Визуализация сосудистой сети аксолота может быть успешно достигнута путем перфузии с липофильным карбоцианиновым красителем DiI. В этом исследовании мы описываем новый протокол для перфузии аксолотля с DiI с использованием перистальтического насоса. Мы также показываем последующую ви…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Brigham & Women's Hospital и March of Dimes. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов Whited Lab за их поддержку и советы.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
