DiI perfusie als een methode voor vasculaire visualisatie in<em> Ambystoma Mexicanes</em
Summary
Met behulp van een lipofiele l, 3'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI) kleuringstechniek, kan Ambystoma mexicanum vasculaire perfusie ondergaan om de vasculatuur gemakkelijk te visualiseren.
Abstract
Perfusionstechnieken zijn eeuwenlang gebruikt om de circulatie van weefsels te visualiseren. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is een soort salamander die is uitgekomen als een essentieel model voor regeneratie studies. Er is weinig bekend over hoe revascularisatie zich voordoet in de context van regeneratie bij deze dieren. Hier rapporteren wij een eenvoudige methode voor visualisatie van de vasculatuur in axolotl via perfusie van 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat (DiI). DiI is een lipofiele carbocyanine kleurstof die onmiddellijk in het plasmamembraan van endotheliale cellen inslaat. Perfusie wordt gedaan met behulp van een peristaltische pomp, zodat DiI de circulatie door de aorta binnentreedt. Tijdens perfusie vloeit de kleur door de bloedvaten van de axolotl en voegt zich in contact met de lipide bilayer van vasculaire endotheelcellen. De perfusieprocedure duurt ongeveer een uur voor een acht-inch axolotl. Onmiddellijk na perfusie wiTh DiI, kan de axolotl met een confocale fluorescerende microscoop worden weergegeven. De DiI licht licht in het rood-oranje bereik uit wanneer het opgewekt wordt met een groen fluorescerend filter. Deze DiI perfusie procedure kan gebruikt worden om de vasculaire structuur van axolotl te visualiseren of patronen van revascularisatie in regenererende weefsels te demonstreren.
Introduction
Visualisatie van vasculatuur speelt een belangrijke rol bij het begrijpen van de structuur en functie van organismen in vele soorten. Vanaf de 16e eeuw met Leonardo da Vinci zijn modellen en grafische voorstellingen van de circulatie 1 bestudeerd. Met behulp van wassen en rubberen matrijzen werden weefsels geperfuseerd om driedimensionale modellen van de vaatwortel te creëren, die de studie van organogenese en pathogenese 1 , 2 toonden. Harsen en wassen werden gekleurd met kleurstoffen zoals India Ink of Carmine Red om hun eenvoudige visualisatie 1 , 2 mogelijk te maken . Deze technieken veroorzaken echter veel problemen omdat hun hoge viscositeiten volledige perfusie van het weefsel van belang 1 verhinderden. Toen het veld verfijnder werd, kwam het gebruik van confocale en elektronenmicroscopen in het spel, waardoor de perfusie techniek Ues weg van gietvormen en naar vloeibare perfusies van de vaatwasser, waarvan sommige toegestaan zijn voor de perfusie en beeldvorming van bloedvaten zonder het aanvankelijke weefsel 3 te vernietigen. DiI, een fluorescerende carbocyanine kleurstof, is een dergelijke vlek die de perfusie van dieren mogelijk maakt zonder schade aan het vaatweefsel.
Carbocyanine kleurstoffen zijn lipofiele kleurstoffen die in contact komen met celmembranen. Deze kleurstoffen zorgen voor makkelijke en onmiddellijke kleuring van vasculaire endotheelcellen, die vervolgens onder een fluorescerende confocale microscoop kunnen worden bekeken. DiI beweegt via laterale diffusie in het lipidemembraan van cellen, zoals blijkt uit de etikettering en opsporing van neuronen 4 . Chemisch geven de twee alkylketens van DiI de hoge affiniteit voor celmembranen, terwijl twee geconjugeerde ringen van een fluorochroom die verantwoordelijk zijn voor het uitzenden van een rode golflengte wanneer het opgewekt wordt door groene fluorescerende lichtfilters> 4. DiI is in veel capaciteiten gebruikt, met inbegrip van succesvolle etikettering van het plasmamembraan en zowel anterograde als retrograde etikettering in neuronen 5 , 6 . DiI is eerder gebruikt in perfusieprotocollen terwijl het visualiseren van de vasculatuur van muizen 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) zijn salamanders die uitsluitend in brakke meren in de buurt van Mexico City, Mexico leven. Deze dieren zijn een belangrijk model geworden voor het begrijpen van regeneratieve processen, aangezien zij volledige ledematen, staart (inclusief zenuwsnoer), delen van het hart en andere inwendige organen, en delen van het oog als volwassenen 8 , 9 kunnen regenereren. Bovendien, met de recente toepassing van genetische hulpmiddelen in axolotls, is nu ongekend inzicht in de moleculen en cellen die deze processen runnen 8 mogelijk. De succesvolle regeneRantsoen van een hele ledemaat vereist een uitgebreid revascularisatieproces, dat een belangrijke rol kan spelen in regeneratie, buiten de traditionele functies van bloedvaten bij het leveren van zuurstof en voedingsstoffen. Het begrijpen van revascularisatie in de context van weefselregeneratie is imperatief. Axolotl bloedvaten zijn eerder met India Ink in beeld gebracht, en hoewel de resultaten intrigerend zijn, is dit proces niet in de daaropvolgende decennia 10 herzien. Wij trachten een DiI perfusie protocol aan te passen dat is ontwikkeld voor gebruik in zoogdieren om een volledige perfusie en visualisatie van de axolotl vasculatuur 7 mogelijk te maken . Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om succesvol te perfectioneren en vervolgens de axolotl circulatie te visualiseren met een DiI-kleuringstechniek. Deze procedure zorgt voor een nauwkeurige visualisatie van octrooibloedschepen in homeostatische weefsels, evenals in regenererende weefsels, en biedt een nieuwe methode voor visualizatioN en analyse van het revascularisatieproces in de axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visualisatie van de vasculatuur van de axolotl kan succesvol worden bereikt via perfusie met de lipofiele carbocyanine kleurstof, DiI. In deze studie beschrijven we een nieuw protocol voor de perfusie van de axolotl met DiI met behulp van een peristaltische pomp. We tonen ook de latere visualisatie van de axolotl vasculatuur met behulp van een fluorescerende confocale microscoop. Dit protocol was een aanpassing van het knaagdier DiI perfusieprotocol gezien in Li et al. 7 , maar grote ver…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het Brigham & Women's Hospital en de March of Dimes. De auteurs willen alle leden van het Whited Lab bedanken voor hun steun en advies.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
