DiI Perfusion som en metode til vaskulær visualisering i<em> Ambystoma mexicanum</em
Summary
Ved anvendelse af en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI) farvningsteknik kan Ambystoma-mexicanum gennemgå vaskulær perfusion for at muliggøre let visualisering af vaskulaturen.
Abstract
Perfusionsteknikker er blevet brugt i århundreder for at visualisere vævscirkulationen. Axolotl (Ambystoma mexicanum) er en art af salamander, der er opstået som en væsentlig model for regenereringsundersøgelser. Lidt er kendt om, hvordan revaskularisering sker i forbindelse med regenerering i disse dyr. Her rapporteres en enkel metode til visualisering af vaskulaturen i axolotl via perfusion af 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat (DiI). DiI er et lipofilt carbocyaninfarvestof, der øjeblikkeligt indsætter i plasmamembranen af endotelceller. Perfusion udføres ved hjælp af en peristaltisk pumpe, således at DiI går ind i kredsløbet gennem aorta. Under perfusion strømmer farvestoffet gennem axolotl's blodkar og inkorporerer i lipid-dobbeltlaget af vaskulære endotelceller ved kontakt. Perfusionsproceduren tager cirka en time for en otte-tommer axolotl. Umiddelbart efter perfusion wiTh DiI, kan axolotl visualiseres med et konfokal fluorescerende mikroskop. DiI udsender lys i rød-orange rækkevidden, når du er begejstret med et grønt fluorescerende filter. Denne DiI-perfusionsprocedure kan anvendes til at visualisere den vaskulære struktur af axolotler eller at demonstrere mønstre af revaskularisering i regenererende væv.
Introduction
Visualisering af vaskulatur spiller en afgørende rolle i forståelsen af organismernes struktur og funktion i mange arter. Fra det 16. århundrede med Leonardo da Vinci er modeller og grafiske fremstillinger af cirkulationen blevet undersøgt 1 . Ved hjælp af voks og gummiforme blev vævene perfuseret for at skabe tredimensionelle modeller af vaskulaturen, hvilket tillod undersøgelsen af organogenese og patogenese 1 , 2 . Harpikser og voks blev farvet med farvestoffer såsom Indien Ink eller carmine rød for at tillade deres nemme visualisering 1 , 2 . Disse teknikker forårsagede imidlertid mange problemer, fordi deres høje viskositeter forhindrede fuld perfusion af vævet af interesse 1 . Da feltet blev mere sofistikeret, kom brugen af konfokale og elektronmikroskoper i spil, og bevægede perfusionsteknik Ues væk fra støbeforme og mod væskeformige perfusioner af vaskulaturen, hvoraf nogle tillod perfusion og billeddannelse af blodkar uden at ødelægge det oprindelige væv 3 . DiI, et fluorescerende carbocyaninfarvestof, er en sådan plet, som tillader perfusion af dyr uden beskadigelse af det vaskulære væv.
Carbocyaninfarvestoffer er lipofile farvestoffer, som indarbejder i cellemembraner ved kontakt. Disse farvestoffer tillader let og øjeblikkelig farvning af vaskulære endotelceller, der derefter kan ses under et fluorescerende konfokalt mikroskop. DiI bevæger sig via lateral diffusion i lipidmembranen af celler, som vist i mærkning og sporing af neuroner 4 . Kemisk giver de to alkylkæder af DiI farvestoffet dets høje affinitet for cellemembraner, mens to konjugerede ringe fra en fluorochrom, der er ansvarlig for udgivelse af en rød bølgelængde, når de er spændt af grønne fluorescerende lysfiltre> 4. DiI er blevet udnyttet i mange kapaciteter, herunder vellykket mærkning af plasmamembranen og både anterograd og retrograd mærkning i neuroner 5 , 6 . DiI er tidligere blevet anvendt i perfusionsprotokoller, mens visualisering af muskulaturen 7 .
Axolotls ( Ambystoma Mexicanes ) er salamanders, der udelukkende bor i brakede søer nær Mexico City, Mexico. Disse dyr er blevet en vigtig model for at forstå regenerative processer, da de kan regenerere fulde lemmer, hale (herunder nerve ledning), dele af hjertet og andre indre organer og dele af øjet som voksne 8 , 9 . Derudover er det nu muligt med den nylige anvendelse af genetiske værktøjer i axolotter at få enestående indsigt i molekylerne og cellerne, der driver disse processer 8 . Den succesfulde regenRation af en hel lem kræver en omfattende revaskularisering proces, som kan spille en vigtig rolle i regenerering ud over blot de traditionelle funktioner blodkar i at yde ilt og næringsstoffer. Forståelse af revaskularisering i forbindelse med vævsregenerering er afgørende. Axolotl blodkar er tidligere blevet visualiseret ved hjælp af Indien Ink, og mens resultaterne var spændende, er denne proces ikke blevet revideret i de efterfølgende årtier 10 . Vi forsøgte at tilpasse en DiI-perfusionsprotokol udviklet til anvendelse i pattedyr for at muliggøre fuldstændig perfusion og visualisering af axolotl vaskulaturen 7 . Denne protokol beskriver de trin, der er taget for at lykkes perfekt, og efterfølgende visualiserer axolotl-cirkulationen med en DiI-farvningsteknik. Denne procedure vil muliggøre præcis visualisering af patent blodkar i homeostatiske væv såvel som i regenererende væv og giver en ny metode til visualizatioN og analyse af revascularization processen i axolotl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Visualisering af aksolotlens vaskulat kan med succes udføres via perfusion med det lipofile carbocyaninfarvestof, DiI. I dette studie beskriver vi en ny protokol til perfusion af axolotl med DiI ved hjælp af en peristaltisk pumpe. Vi viser også den efterfølgende visualisering af axolotl vaskulaturen ved hjælp af et fluorescerende konfokalmikroskop. Denne protokol var en tilpasning af gnaver DiI-perfusionsprotokollen set i Li et al. 7 , men store forskelle mellem gnaver og aksolotl k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Brigham & Women's Hospital og March of Dimes. Forfatterne vil gerne takke alle medlemmer af det hvide lab for deres støtte og rådgivning.
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts – standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
