डिसी परफ़्यूज़न में संवहनी विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक विधि के रूप में<em> अंबिस्टोम मैक्सिकनम</em
Summary
लाइपोफिलिक 1,1'-डायोक्टाडेसी -3,3,3 ', 3'-टेट्रामैथिलैन्डोकार्बॉकाइनिन प्रक्लोरेट (डीआई) स्टेनिंग तकनीक का प्रयोग करना, अम्बुस्टोमा मैनेट्यूम vasculature के आसान दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए संवहनी छिड़काव से गुजर सकता है।
Abstract
छिड़काव तकनीकों का उपयोग सदियों से किया गया है ताकि ऊतकों के संचलन की कल्पना की जा सके। एक्सोलोटल (एम्बैस्टोमा मैनेट्यूम) सैलामिंडर की एक प्रजाति है जो उत्थान के अध्ययन के लिए एक आवश्यक मॉडल के रूप में उभरा है। इन जानवरों के पुनर्जन्म के संदर्भ में, रेग्युलायराइजेशन के बारे में बहुत कुछ पता नहीं है। यहां हम 1,1'-डायोक्टाडेसी -3,3,3 ', 3'-टेट्रामिथिलंडोकार्बोकायनिन प्रक्लेलोरेनेट (डीआईआई) के छिड़काव के माध्यम से एक्सोलॉटल में vasculature के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक सरल विधि की रिपोर्ट करते हैं। डीआईआई एक लाइपोफिलिक कार्बोकाइनाइन डाई है जो अंतःस्थल कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में तत्काल सम्मिलित होती है। इरिस्टाइटी पंप का उपयोग करके छिड़काव किया जाता है ताकि डीआईआई महाधमनी के माध्यम से संचरण में प्रवेश कर सके। छिड़काव के दौरान, ऐंजोलॉटल के रक्त वाहिकाओं के माध्यम से डाई प्रवाह होता है और संपर्क पर संवहनी एंडोथिलियल कोशिकाओं के लिपिड बिलेयर में शामिल होता है। छिड़काव की प्रक्रिया में आठ इंच के अक्षोटोलल के लिए लगभग एक घंटे लगते हैं। छिड़काव वाई के तुरंत बादवें डीआई, एक्सोलोटल को एक कन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के साथ देखा जा सकता है। डीआईआई लाल-नारंगी रेंज में प्रकाश का उत्सर्जन करता है जब हरा फ्लोरोसेंट फिल्टर के साथ उत्साहित होता है। इस DiI छिड़काव प्रक्रिया का उपयोग एक्सोलोटल्स के संवहनी संरचना को देखने के लिए या फिर ऊतकों को पुनर्जन्मित करने में पुनरुत्पादन के पैटर्न को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
कई प्रजातियों में जीवों के संरचना और कार्य को समझने में vasculature का विज़ुअलाइज़ेशन महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। 16 वीं शताब्दी में लियोनार्डो दा विंसी के साथ, मॉडलों और परिसंचरण के ग्राफिक प्रतिनिधित्व 1 का अध्ययन किया गया है। मोक्स और रबर के ढालना का उपयोग करना, ऊतकों को vasculature के तीन आयामी मॉडल बनाने के लिए लगाया गया था, जो जीवसंचार और रोगजनन 1 , 2 के अध्ययन के लिए अनुमति देता है। रेजिन और मोक्स रंगों के साथ रंगे थे जैसे कि भारत इंक या कारमिन लाल, जो उनके आसान दृश्य 1 , 2 के लिए अनुमति देते हैं। हालांकि, इन तकनीकों के कारण कई मुद्दों के कारण उनकी ऊंची चिपचिपाहट ब्याज 1 के ऊतक के पूर्ण छिड़काव को रोका गया। जैसा कि क्षेत्र अधिक परिष्कृत हो गया, confocal और इलेक्ट्रॉन सूक्ष्मदर्शी का उपयोग खेलने में आया, छिड़काव techniq चलती प्रारंभिक ऊतक 3 को नष्ट किए बिना डाली-मोल्ड और वास्क्यूलेक्चर के तरल रूप से दूर जाने से, जिनमें से कुछ रक्त वाहिकाओं के छिड़काव और इमेजिंग के लिए अनुमति देते हैं। डीआईआई, एक फ्लोरोसेंट कार्बोकाइनाइन डाई, एक ऐसे दाग है जो संवहनी ऊतक को नुकसान न किए जाने वाले जानवरों के छिड़काव की अनुमति देता है।
कार्बोकाइनाइन रंजक लाइपोफिलिक रंजक होते हैं जो संपर्क पर सेल झिल्ली में शामिल होते हैं। ये रंजक संवहनी एन्डोथेलियल कोशिकाओं के आसान और तात्कालिक धुंधला होने की अनुमति देते हैं, जो तब फ्लोरोसेंट इन्फोकल माइक्रोस्कोप के नीचे देखे जा सकते हैं। डीआईआई कोशिकाओं के लिपिड झिल्ली में पार्श्व प्रसार के माध्यम से चलता है, जैसा कि न्यूरॉन्स 4 के लेबलिंग और अनुरेखण में दिखाया गया है। रासायनिक रूप से, डीआईआई के दो अल्किल जंजीरों को कोशिका झिल्ली के लिए इसकी उच्च आत्मीयता देता है, जबकि फ्लोरोक्रोम से दो संयुग्मित छल्ले जो लाल तरंगदैर्ध्य को उत्सर्जित करने के लिए जिम्मेदार होता है जब हरे फ्लोरोसेंट प्रकाश फिल्टर> 4 डीआईआई का उपयोग कई क्षमताओं में किया गया है, जिसमें प्लाज्मा झिल्ली का सफल लेबलिंग और न्यूरॉन्स 5 , 6 में एंटीओग्रेड और प्रतिगामी लेबलिंग दोनों शामिल हैं। चूहों 7 के vasculature visualizing करते समय DiI पहले छिड़काव प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था
एक्सोलोटल्स ( एम्बीस्टोमा मैनेट्यूम ) वे सलामंडर्स हैं जो मैक्सिको सिटी, मैक्सिको के पास खारा झीलों में विशेष रूप से रहते हैं। ये जानवर पुनर्योजी प्रक्रियाओं को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल बन गए हैं क्योंकि वे पूरे अंग, पूंछ (तंत्रिका कॉर्ड सहित), दिल के हिस्सों और अन्य आंतरिक अंगों और आंखों के हिस्से को वयस्क 8 , 9 के रूप में पुनर्जीवित कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, अक्षतंतु में आनुवंशिक उपकरणों के हालिया आवेदन के साथ, इन प्रक्रियाओं को चलाने वाले अणुओं और कोशिकाओं में अभूतपूर्व जानकारी अब संभव है 8 । सफल रीजेंनेएक पूरे अंग के राशन के लिए एक व्यापक पुनरोद्धार प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जो ऑक्सीजन और पोषक तत्व प्रदान करने में रक्त वाहिकाओं के पारंपरिक कार्यों से परे पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है। ऊतक पुनर्जनन के संदर्भ में पुनरुत्पादन को समझना अनिवार्य है। एक्सलोट्ल रक्त वाहिकाओं को भारत इंक का उपयोग करके पहले देखा गया है, और जब परिणाम दिलचस्प थे, तो इस प्रक्रिया को बाद के दशकों में फिर से दोबारा गौर नहीं किया गया है। हमने एक्सलोटल वैस्क्यूचर 7 के संपूर्ण छिड़काव और दृश्यता की अनुमति देने के लिए स्तनधारियों में इस्तेमाल के लिए डिआईआई छिड़काव प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की मांग की थी। यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक छेड़छाड़ करने और बाद में डीआईआई स्नेनिंग तकनीक के साथ एक्सोलोटल संचलन की कल्पना करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया होमोस्टेटिक ऊतकों में पेटेंट रक्त वाहिकाओं के सटीक दृश्य के लिए, साथ ही साथ ऊतकों को पुनर्जन्म करने की भी अनुमति देती है, और दृश्यता के लिए एक उपन्यास विधि प्रदान करती हैए और एक्सलोट्ल में पुनर्विकरण प्रक्रिया के विश्लेषण।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक्सीलोटल के व्युत्पत्ति का विज़ुअलाइज़ेशन लाइपोफिलिक कारबोकायनिन डाई, डीआईआई के साथ छिड़काव के माध्यम से सफलतापूर्वक पूरा किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम डीआईआई के साथ एक्सोलोटल के छिड़काव के ल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को ब्रिघम एंड वुमेन्स हॉस्पिटल और मार्च ऑफ डाइम्स द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक अपने समर्थन और सलाह के लिए व्हाइटीब लैब के सभी सदस्यों का धन्यवाद करना चाहते हैं।
Materials
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC |
References
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