Étude de l'expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire
Summary
Nous rapportons deux protocoles de synchronisation cellulaire qui fournissent un contexte pour étudier les événements liés à des phases spécifiques du cycle cellulaire. Nous montrons que cette approche est utile pour analyser la régulation de gènes spécifiques dans un cycle cellulaire non perturbé ou lors de l'exposition à des agents affectant le cycle cellulaire.
Abstract
Le programme d'expression génique du cycle cellulaire représente une étape critique pour la compréhension des processus dépendants du cycle cellulaire et leur rôle dans des maladies telles que le cancer. L'analyse d'expression génique régulée par un cycle cellulaire dépend de la synchronisation cellulaire en phases spécifiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant deux protocoles de synchronisation complémentaires qui sont couramment utilisés pour étudier la variation périodique de l'expression des gènes pendant le cycle cellulaire. Les deux procédures sont basées sur le blocage transitoire du cycle cellulaire dans un point défini. Le protocole de synchronisation par le traitement par l'hydroxyurée (HU) conduit à une arrestation cellulaire à la phase G1 / début S en retard, et la libération de l'arrestation médiée par l'HU fournit une population cellulaire progressant uniformément à travers S et G2 / M. Le protocole de synchronisation par le traitement par la thymidine et le nocodazole (Thy-Noc) bloque les cellules dans la mitose précoce et la libération de l'arrestation médiée par Thy-Noc fournit une population cellulaire synchronisée adaptée à la phase G1 et à la phase S-enEssayer des études. L'application des deux procédures nécessite une surveillance des profils de distribution du cycle cellulaire, qui est habituellement effectuée après la coloration par l'iodure de propidium (PI) des cellules et l'analyse de la teneur en ADN par cytométrie en flux. Nous montrons que l'utilisation combinée de deux protocoles de synchronisation est une approche robuste pour déterminer clairement les profils transcriptionnels des gènes qui sont différentiellement réglementés dans le cycle cellulaire ( c.-à-d. E2F1 et E2F7) et par conséquent avoir une meilleure compréhension de leur rôle dans le cycle cellulaire Processus. En outre, nous montrons que cette approche est utile pour l'étude des mécanismes sous-jacents aux thérapies à base de médicaments ( c'est-à-dire la mitomycine C, un agent anticancéreux), car elle permet de discriminer les gènes qui réagissent à l'agent génotoxique de ceux qui sont uniquement affectés par des perturbations du cycle cellulaire Imposé par l'agent.
Introduction
La transition à travers toutes les phases du cycle cellulaire est couplée à un programme d'expression génique étroitement réglementé. Ce «aller et à quitter» coordonné de la transcription des gènes tout au long du cycle cellulaire est censé être sous le contrôle de systèmes de régulation transcriptionnels complexes, en régulant non seulement le moment mais aussi les niveaux d'expression des gènes. La dérégulation des composants clés du cycle cellulaire est connue pour contribuer au développement de plusieurs maladies et est une caractéristique bien établie de la tumorigénèse 1 , 2 . Les analyses transcriptomiques à l'échelle du génome réalisées dans des cellules de levure et de mammifères ont révélé qu'un grand nombre de gènes présentent des schémas périodiques d'expression des gènes dans le cycle cellulaire, ce qui suggère que la fluctuation de la transcription pendant le cycle cellulaire reflète l'exigence temporelle d'un produit génique donné Dans une phase précise 3 , 4 , </suP> 5 .
Une tâche majeure dans l'étude de l'expression des gènes régulés par un cycle cellulaire est la synchronisation des cellules dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. La synchronisation cellulaire aide à interpréter l'association d'un motif d'expression génique à une transition de phase de cycle cellulaire particulière et a permis de mieux comprendre la régulation et la fonction de nombreux gènes. La synchronisation cellulaire est également importante pour étudier le mécanisme d'action des médicaments anticancéreux, car les agents chimiothérapeutiques sont connus pour affecter à la fois l'expression des gènes ainsi que la cinétique du cycle cellulaire 6 , 7 . Néanmoins, il est souvent difficile de déterminer si les différences d'expression des gènes résultant du traitement avec ces agents sont une réponse directe au traitement ou sont simplement la conséquence de changements dans les profils du cycle cellulaire. Pour distinguer ces possibilités, l'expression des gènes doit être analysée dans les cellules qui ont été sYnchronisé avant l'addition du médicament chimiothérapeutique.
À l'exception de certaines cellules primaires telles que les cellules lymphoïdes fraîchement isolées – qui constituent une population cellulaire homogène synchronisée dans G0 8 -, les lignées cellulaires établies in vitro croissent de manière asynchrone en culture. Dans des conditions de croissance régulières, ces cellules cycliques asynchrones se retrouvent dans toutes les phases du cycle cellulaire mais, de préférence, dans G1 9 . Par conséquent, ce contexte ne fournit pas un scénario optimal pour les analyses d'expression fonctionnelle ou génétique dans une phase de cycle cellulaire spécifique ( p. Ex. G1, S, etc.). Les lignées cellulaires immortalisées non transformées ( p. Ex . Les fibroblastes) peuvent être synchronisées avec les méthodes dites physiologiques 10 . Ces méthodes sont basées sur les caractéristiques de cellules primaires retenues des cellules non transformées, telles que l'inhibition du contact cellulaire et la dépendance du facteur de croissance afin de continuer à faire du vélo. SuppressionDe sérum en combinaison avec une inhibition de contact rend les cellules non transformées arrêtées à G0 / G1. Cependant, l'entrée et la progression du cycle cellulaire synchronisée nécessitent souvent une sous-culture, qui implique également un détachement artificiel des cellules et une régénération 10 . Plus important encore, cette méthode n'est pas adaptée à la synchronisation des lignées cellulaires transformées, la grande majorité des lignées cellulaires établies actuellement utilisées, caractérisées par manque d'inhibition de la croissance médiée par contact cellulaire ou de réponse au retrait du facteur de croissance. Ainsi, il est clair que des méthodes alternatives sont nécessaires pour une synchronisation cellulaire efficace dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. En termes généraux, les méthodes de synchronisation les plus fréquemment utilisées sont basées sur une inhibition chimique ou pharmacologique transitoire d'un point défini du cycle cellulaire, typiquement la synthèse de l'ADN ou la formation de la broche mitotique. L'inhibition de la synthèse de l'ADN synchronise les cellules en les arrêtant à la fin de la phase G1 ou début de la S. Cela peut être achevéPar addition de composés tels que la mimosine, un inhibiteur de la biosynthèse des nucléotides 11 , 12 , de l'aphidicoline, un inhibiteur des ADN polymerases 13 , 14 , de l'hydroxyurée, un inhibiteur de la ribonucléotide réductase 15 , 16 ou des quantités excessives de thymidine 17 , 18 . D'autre part, les inhibiteurs de la polymérisation des microtubules, tels que la colchicine ou le nocodazole, peuvent bloquer la formation de la broche mitotique conduisant à une synchronisation cellulaire au début de la phase M 19 , 20 , 21 .
Dans ce travail, nous décrivons une méthode impliquant deux protocoles de synchronisation complémentaires basés sur l'inhibition chimique transitoire pour étudier l'expression de gènes régulés par cycle cellulaire à l'ARNmniveau. Cette méthode est fondamentale pour définir le rôle des gènes du cycle cellulaire dans les processus spécifiques du cycle cellulaire. En outre, il fournit un cadre général pour étudier l'impact des traitements anticancéreux afin de détecter avec précision les gènes sensibles aux médicaments et de minimiser les mauvaises interprétations dérivées des perturbations de la progression du cycle cellulaire générées par ces médicaments.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'analyse des gènes régulés par ajustement précis impliqués dans des rôles transitoires et spécifiques dans le cycle cellulaire nécessite une population cellulaire uniforme. Beaucoup de chercheurs utilisent couramment des lignées de cellules tumorales établies de longue date à cette fin, et une variété de méthodes ont été développées pour obtenir des populations de cellules synchrones (ou partiellement synchrones), dans le but d'accumuler autant de cellules que possible dans des phases de cycle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres des laboratoires Zubiaga et Altmeyer pour des discussions utiles et pour un soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), du gouvernement basque (IT634-13 et KK-2015/89) et de l'Université du Pays Basque UPV / EHU ( UFI11 / 20).
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
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