Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек
Summary
Мы сообщаем о двух протоколах синхронизации ячеек, которые предоставляют контекст для изучения событий, связанных с конкретными фазами клеточного цикла. Мы показываем, что этот подход полезен для анализа регуляции специфических генов в невозмущенном клеточном цикле или при воздействии агентов, влияющих на клеточный цикл.
Abstract
Программа экспрессии генов клеточного цикла представляет собой критический шаг для понимания процессов, зависящих от клеточного цикла, и их роли в таких заболеваниях, как рак. Анализ экспрессии генов, регулируемый клеточным циклом, зависит от синхронизации клеток на определенные фазы. Здесь мы описываем метод, использующий два дополнительных протокола синхронизации, которые обычно используются для изучения периодического изменения экспрессии генов во время клеточного цикла. Обе процедуры основаны на временном блокировании клеточного цикла в одной определенной точке. Протокол синхронизации обработкой гидроксимочевиной (HU) приводит к клеточному аресту в поздней фазе G1 / ранней S, а высвобождение из опосредованного HU задержания обеспечивает популяцию клеток, равномерно прогрессирующую через S и G2 / M. Протокол синхронизации лечения тимидином и нокодазолом (Thy-Noc) блокирует клетки в раннем митозе и высвобождение из опосредованного Thy-Noc остановки обеспечивает синхронизированную клеточную популяцию, подходящую для фазы G1 и S-фазыПопробуйте исследования. Применение обеих процедур требует мониторинга профилей распределения клеточного цикла, которые обычно выполняются после окрашивания пропидиум иодидом (PI) клеток и опосредованного потоком цитометрии анализа содержания ДНК. Мы показываем, что совместное использование двух протоколов синхронизации является надежным подходом к четкому определению транскрипционных профилей генов, которые дифференциально регулируются в клеточном цикле ( то есть E2F1 и E2F7) и, следовательно, лучше понимать их роль в клеточном цикле процессы. Кроме того, мы показываем, что этот подход полезен для изучения механизмов, лежащих в основе лекарственной терапии ( то есть митомицина С, противоопухолевого агента), поскольку он позволяет различать гены, которые реагируют на генотоксический агент от тех, на кого воздействуют только возмущения клеточного цикла Наложенных агентом.
Introduction
Переход через все фазы клеточного цикла связан с плотно регулируемой программой экспрессии генов. Считается, что это скоординированное «включение и выключение» транскрипции генов в течение клеточного цикла находится под контролем сложных регуляторных систем транскрипции, регулирующих не только время, но также и уровни экспрессии генов. Известно, что дерегулирование компонентов ключевого клеточного цикла способствует развитию нескольких заболеваний и является хорошо зарекомендовавшим себя признаком опухолевого генеза 1 , 2 . Проведенные в клетках дрожжей и млекопитающих широкомасштабные транскриптомические анализы показали, что большое количество генов проявляют периодические образцы экспрессии генов в клеточном цикле, что указывает на то, что флуктуация транскрипции во время клеточного цикла является отражением временного требования к данному продукту гена В точной фазе 3 , 4 , </suP> 5 .
Основная задача изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, – это синхронизация клеток на фазах конкретного клеточного цикла. Синхронизация клеток помогает интерпретировать ассоциацию шаблона экспрессии генов с конкретным фазовым переходом на клеточный цикл, и это привело к лучшему пониманию регуляции и функции многочисленных генов. Синхронизация клеток также важна для изучения механизма действия противораковых лекарств, поскольку известно, что химиотерапевтические агенты влияют как на экспрессию генов, так и на кинетику клеточного цикла 6 , 7 . Тем не менее, часто бывает трудно определить, являются ли различия в экспрессии генов, возникающие в результате лечения этими агентами, прямым ответом на лечение или являются просто следствием изменений в профилях клеточного цикла. Чтобы различать эти возможности, экспрессию генов следует анализировать в клетках, которые былиСинхронизируется до добавления химиотерапевтического препарата.
За исключением некоторых первичных клеток, таких как недавно выделенные лимфоидные клетки, которые представляют собой гомогенную популяцию клеток, синхронизированную в G0 8 , in vitro установленные клеточные линии асинхронно растут в культуре. При регулярных условиях роста эти асинхронно циклические клетки находятся во всех фазах клеточного цикла, но предпочтительно в G1 9 . Следовательно, этот контекст не обеспечивает оптимальный сценарий для анализа функциональных или генных экспрессии в конкретной фазе клеточного цикла ( например, G1, S и т. Д.). Не трансформированные иммортализованные клеточные линии ( например, фибробласты) могут быть синхронизированы с так называемыми физиологическими методами 10 . Эти методы основаны на сохраненных первичных клеточных характеристиках нетрансформированных клеток, таких как ингибирование клеточного контакта и зависимости фактора роста, чтобы продолжить циклирование. УдалениеСыворотки в сочетании с контактным торможением делает нерепрессированные клетки, арестованные в G0 / G1. Однако синхронизированный вход и прогрессирование циклического цикла часто требует субкультуры, которая также включает в себя искусственное отслоение клеток и повторное покрытие 10 . Самое главное, этот метод не подходит для синхронизации трансформированных клеточных линий, подавляющее большинство установленных клеточных линий, которые в настоящее время используются, характеризуется отсутствием клеточного опосредованного клеточным ингибированием роста или ответа на вывод фактора роста. Таким образом, ясно, что для эффективной синхронизации соты в конкретных фазах клеточного цикла требуются альтернативные методы. В общих чертах наиболее часто используемые методы синхронизации основаны на временном химическом или фармакологическом ингибировании одной определенной точки клеточного цикла, как правило, синтезе ДНК или образовании митотического веретена. Ингибирование синтеза ДНК синхронизирует клетки, останавливая их в поздней фазе G1 или ранней S. Это может быть achiПутем добавления таких соединений, как мимозин, ингибитора биосинтеза нуклеотидов 11 , 12 , афидиколина, ингибитора ДНК-полимераз 13 , 14 , гидроксимочевины, ингибитора рибонуклеотидредуктазы 15 , 16 или избыточных количеств тимидина 17 , 18 . С другой стороны, ингибиторы полимеризации микротрубочек, такие как колхицин или нокодазол, способны блокировать образование митотического веретена, приводя к синхронизации клеток на ранней фазе M 19 , 20 , 21 .
В этой работе мы описываем метод, включающий два дополнительных протокола синхронизации, основанных на переходном химическом ингибировании для изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, в мРНКуровень. Этот метод является фундаментальным для определения роли генов клеточного цикла в конкретных процессах клеточного цикла. Кроме того, он обеспечивает общую структуру для изучения влияния противоопухолевых обработок, чтобы точно определить гены, чувствительные к лекарственным средствам, и свести к минимуму неверные истолкования, вызванные нарушениями в прогрессировании клеточного цикла, вызванными этими препаратами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ тонкоизмельченных регулируемых генов, участвующих в переходных и специфических ролях в клеточном цикле, требует однородной клеточной популяции. Многие исследователи обычно используют длинные линии опухолевых клеток для этих целей, и были разработаны различные методы для пол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов лабораторий Zubiaga и Altmeyer за полезные обсуждения и техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами испанского министерства (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), правительством Басков (IT634-13 и KK-2015/89) и Университетом Страны Басков UPV / EHU ( UFI11 / 20).
Materials
| DMEM, high glucose, GutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| Thymidine | SIGMA | T1895-5G | Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | Freshly prepared |
| Mitomycin C from Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC |
| Dimethyl sulfoxide | SIGMA | D2650 | |
| Propidium iodide | SIGMA | P4170 | Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light. |
| PBS pH 7.6 | Home made | ||
| Ethanol | PANREAC | A3678,2500 | |
| Chloroform | SIGMA | C2432 | |
| Sodium Citrate | PANREAC | 131655 | |
| Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | Thermo Fisher Scientific | EN0531 | |
| TRIzol Reagent | LifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 antibody | Cell Signaling | 4129 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-Cyclin B1 antibody | Cell Signaling | 4135 | 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC |
| Anti-β-actin | SIGMA | A-5441 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody | Invitrogen | R37116 | Specified in the protocol |
| Secondary anti-mouse-HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-3697 | 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT |
| Forward E2F1 antibody (human) TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F1 antibody (human) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward E2F7 antibody (human) GGAAAGGCAACAGCAAACTCT | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse E2F7 antibody (human) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse p21Cip1 antibody (human) TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward TBP antibody (human) reference gene | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse TBP antibody (human) | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward Oxa1L antibody (human) reference gene CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L antibody (human) CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG | Biolegio | Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | ||
| Corning Costar cell culture plates 6 well | Corning | 3506 | |
| Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 R | |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | A28567 |
References
- Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
- Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
- Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
- Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
- Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
- Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
- McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
- Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
- Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
- Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
- Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
- Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
- Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
- Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
- Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
- Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
- Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
- Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
- Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
- Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
- Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
- Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
- Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
- Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
- Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
- Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
- Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
- Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
- Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
- Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
- Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
- Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
- Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
- Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
- Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
- St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
- Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).
