Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen
Summary
Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.
Abstract
Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH 4 OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.
Introduction
Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt 1 . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine und zellulären Funktionen 1 , 2 nachteilig beeinflussen. Emerging Research hat vorgeschlagen, dass 3-NT eine wichtige Rolle bei entzündlichen Zuständen spielen kann 3 , neurodegenerative Erkrankungen 4 , 5 , Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6 und Diabetes 7 sowie Zustände im Zusammenhang mit oxidativem Stress. Doch diese obseRvations basiert auf Ergebnissen aus Methoden, denen keine Sensitivität und / oder Selektivität fehlt 8 , 9 , 10 , 11 . Die enormen 3-NT-Konzentrationsbereiche für die bisher in der Literatur berichteten biologischen Proben zeigen, dass mit diesen Assays ernsthafte analytische Probleme verbunden sind und technische Verbesserungen erforderlich sind, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und ihre Rolle in der Pathologie dieser Bedingungen zu überprüfen .
Die Quantifizierung von freiem 3-NT in biologischen Matrizen stellt eine besondere Herausforderung für Mensch und Instrument 8 , 9 , 10 , 11 dar . Erstens verlangt der Spurengrad des endogenen 3-NT eine hochempfindliche Detektion; Zweitens die Existenz zahlreicher strukturell ähnlicher Analoga, insbesondere Tyrosin, die inGroßer Überschuss erfordert einen hohen Grad an Selektivität; Drittens erfordert die artefaktuelle Bildung von 3-NT durch Tyrosin-Nitrierung mit ubiquitärem Nitrat und Nitrit eine besondere Berücksichtigung während der Probenvorbereitung, um eine falsche Überschätzung von 3-NT zu vermeiden.
Unter einer Vielzahl von Methoden, die zur Messung von 3-NT eingesetzt wurden, wurde MS / MS aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und Selektivität 11 , 12 , 13 , 14 als Goldstandardmethode angesehen. Gaschromatographie (GC) gekoppelte MS / MS bietet die beste Empfindlichkeit, jedoch sind die unentbehrlichen Probenderivatisierungsschritte zu langwierig und zeitaufwendig, um für den klinischen Nutzen 15 , 16 effizient zu sein. LC-MS / MS erfordert keine komplexe Musterderivatisierung und ist damit vielversprechender. Dennoch gibt es mehrere Hindernisse zu überwinden wie die seDie in der Literatur berichteten LC-MS / MS-Methoden müssen sich für die Messung von niedrigen 3-NT 7 , 17 , 18 verbessern und die relativ lange Durchlaufzeit für die Hochdurchsatzanwendungen 12 , 13 , 17 , 19 verkürzen .
Darüber hinaus spielt bei der Betrachtung klinischer Anwendungen die verwendete biologische Matrix eine bedeutende Rolle. Es sollte einfach und kostengünstig zu erhalten und nicht-invasiv, wenn möglich 20 , 21 , 22 . Plasma, die traditionell verwendete Probe in der Literatur, ist keine klinisch wünschenswerte Matrix, so dass eine Methodik, die Urin verwendet, die nicht-invasiv und kostengünstig ist, gesucht wurde.
Mehrere Versuche zu entwickeln relUnd spezielle LC-MS / MS-Methoden wurden mit Urin 9 , 10 , 11 gemacht . Allerdings haben sie alle nicht selektiv, zuverlässig oder effizient genug für die klinische Anwendung. Die Effektivität der vorherrschenden SPE mit herkömmlicher Umkehrphasenpatrone (C18-Typ) als Probenreinigung für die 3-NT-Analyse wurde in Frage gestellt und eine sequentielle SPE von starkem Kationenaustausch (SCX) und umgekehrter Phase C18-OH wurde vorgeschlagen 6 , 7 , 19 Eine kürzlich entwickelte LC-MS / MS-Methode verwendete ein mehrstufiges Reinigungsverfahren von manueller C18 SPE, präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Online-SPE zur Analyse von 3-NT 23 . Obwohl diese Methode für klinische Zwecke empfindlich genug war, mit einem LLOQ von 0,041 nM, war der Cleanup-Prozess intensiv und langwierig und requiRote 3 ml Urin, die ihre Durchführbarkeit für Hochdurchsatz begrenzt. Ein molekular geprägtes Polymer wurde als SPE-Sorptionsmittel verwendet, um die Effizienz des Reinigungsverfahrens 14 zu verbessern, aber das resultierende LLOQ (0,7 & mgr; g / ml) war für klinische Proben nicht niedrig genug. Eine andere Methode erforderte zweidimensionale (2D) LC-MS / MS- und Immunoaffinitätschromatographie zur Probenreinigung, um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,022 nM 24 zu erreichen . Während alle diese Methoden Fortschritte bei der Bewertung von 3-NT gemacht haben, hat keiner die Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz für klinische Anwendungen erreicht.
Um die Pathologie der freien 3-NT und seine Rolle als Biomarker für oxidativen Stress im klinischen Umfeld zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt , die einfache, effiziente, genaue und präzise ist, so dass für Hochdurchsatz – klinische Anwendungen 25. Ein miniaturisierter Mischmodus Kation exc(MCX) 96-well Extraktion Mikroplatte wurde implementiert, um eine einfache und effektive Probenreinigung und Anreicherung von 3-NT in einer einzigen Extraktion zu erreichen, die die Nachteile bei den bestehenden Methoden, die eine Derivatisierung, Verdampfung und 2D-LC erfordern, umgehen. Die Flüssigkeitschromatographie mit 0,01% HCOOH als Additiv in der mobilen Phase lieferte eine verbesserte Signalantwort mit einer schnellen Zykluszeit. Die Selektivität wurde durch die Anwendung einer milden NH 4 OAc-Elutionslösung für die selektive Elution von 3-NT und die Verwendung des MRM-Übergangs für sowohl 3-NT als auch den internen Standard (IS) weiter verbessert. Der Matrixeffekt wurde durch die Verwendung einer reduzierten Menge eines bevorzugten 13 C-markierten Isotopen IS zur Quantifizierung kompensiert. Mit dem Aufkommen dieser Methodik werden Forscher und Kliniker in der Lage sein, die Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen zu überprüfen und die Auswirkungen von oxidativem Stress weiter zu erforschen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays 8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würden Scott Howard und Abigail Marinack für die allgemeine Unterstützung und Koordination dieser Arbeit anerkennen.
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
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