임상 응용을위한 인간의 소변에서 3- 니트로 타이로신의 소형 고체 상 추출 및 LC-MS / MS 검출의 통합
Summary
혼합 모드 양이온 교환 (MCX) 96- 웰 마이크로 플레이트상에서 효율적인 고체상 추출과 결합 된 선택적이고 민감한 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석법 (LC-MS / MS)이 유리 3- 니트로 티로신의 측정을 위해 개발되었다 3-NT)을 임상 적으로 사용하기에 적합합니다.
Abstract
Free 3- nitrotyrosine (3-NT)은 산화 스트레스에 대한 가능한 바이오 마커로 광범위하게 사용되어 왔습니다. 3-NT의 증가 된 수준은 다양한 병리학 적 조건에서보고되었다. 그러나 기존의 방법은 3-NT의 낮은 내인성 수준을 안정적으로 측정하는 데 필요한 충분한 감도 및 / 또는 특이성이 결여되어 있으며 임상 적용에 너무 복잡합니다. 따라서, 3-NT의 수준을 정확히 정량화하고 병리학 적 조건에서 3-NT의 역할을 검증하기 위해서는 분석적 개선이 시급히 필요하다. 이 프로토콜은 비 침습성 바이오 마커로서 인간의 소변에서 3-NT의 신속하고 정확한 측정을위한 소형 고체상 추출 (SPE)과 결합 된 새로운 액체 크로마토 그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS / MS) 검출의 개발을 제시합니다 산화 스트레스. SPE는 96- 웰 플레이트를 사용하여 지루한 유도체 화 및 증발 단계없이 샘플 클린업 및 분석 물 농축을 결합함으로써 공정을 현저히 단순화시켰다, 용매 소비, 폐기물 처리, 오염 위험 및 전반적인 처리 시간 감소. SPE 용출 용액으로서 pH 9에서 25 mM 암모늄 아세테이트 (NH 4 OAc)를 사용함으로써 선택성이 실질적으로 향상되었다. 질량 분석법 신호 응답은 다중 반응 모니터링 (MRM) 전환의 조정을 통해 향상되었습니다. 펜타 플루오로 페닐 (PFP) 컬럼 (150 mm x 2.1 mm, 3 μm)에서 첨가제로 0.01 % HCOOH를 사용하면 신호 응답이 2.5 배 향상되었고 전체 실행 시간이 7 분으로 단축되었습니다. 10 pg / mL (0.044 nM)의 정량 하한 (LLOQ)이 달성되어보고 된 분석법에 비해 현저한 민감도 향상을 나타냅니다. 이 간단하고 신속한 선택적이고 민감한 방법으로 24 시간 동안 2 장의 소변 샘플 (n = 192)을 처리 할 수 있습니다. 현저하게 개선 된 분석 성능과 비 침습성 및 저렴한 소변 샘플링을 고려하면, 제안 된 분석법은 전임상 및 임상연구.
Introduction
최근 임상 연구에서 산화 스트레스의 영향이 최전방으로 치닫고 있습니다 1 . 연구되는 바이오 마커 중 하나는 반응성 질소 종 (RNS)이 티로신 (catecholamine neurotransmitter precursor)과 상호 작용할 때 형성된 안정한 제품인 3- 니트로 티로신 (3-NT)입니다. 3-NT는 생체 내 RNS의 바이오 마커로서 임상 적 가치를 가질 수 있지만 , 티로신의 성질과 기능의 실질적인 변화는 해당 단백질과 세포 기능에 악영향을 미칠 수 있습니다 1 , 2 . 신생 연구는 3-NT가 염증성 질환 3 , 신경 퇴행성 질환 4 , 5 , 심혈관 질환 6 및 당뇨병 7 뿐만 아니라 산화 스트레스와 관련된 상태에서 중요한 역할을 할 수 있다고 제안했다. 그러나, 이러한 obse민감도 및 / 또는 선택성이 결여 된 방법론 8 , 9 , 10 , 11의 결과에 근거합니다. 이전에 문헌에보고 된 생물학적 시료에 대한 거대한 3-NT 농도 범위는 심각한 분석 문제가 이러한 분석법과 관련되어 있으며 3-NT 수준을 정확하게 계량화하고 이러한 병리 현상에서의 역할을 확인하기위한 기술적 개선이 필요함을 보여줍니다 .
생물학적 기질에서 유리 3-NT의 정량은 사람과 도구 8 , 9 , 10 , 11에 특별한 도전이됩니다. 첫째, 내인성 3-NT의 추적 수준은 매우 민감한 탐지를 요구합니다. 둘째로 구조적으로 유사한 많은 유사체, 특히 티로신이 존재한다.광대 한 과잉은, 높은 선택성을 요구한다; 셋째, 유비쿼터스 질산염과 아질산염으로 티로신 니트로 화에 의한 3-NT의 인공 생성물은 3-NT의 잘못된 과대 평가를 피하기 위해 시료 준비 중에 특별한 고려가 필요하다.
3-NT를 측정하기 위해 사용 된 다양한 방법론 중에서 MS / MS는 탁월한 감도 및 선택성 11 , 12 , 13 , 14 로 인해 금 표준 방법으로 간주되었습니다. 가스 크로마토 그래피 (GC) 결합 MS / MS가 가장 우수한 감도를 제공하지만 필수적인 유도체 화 단계는 임상 유틸리티 15 , 16에 비해 너무 지루하고 시간 소모적입니다. LC-MS / MS는 복잡한 표본 유도체 화를 필요로하지 않으므로 더 유망한 옵션입니다. 그럼에도 불구하고 se와 같은 극복해야 할 몇 가지 장애물이 있습니다.낮은 농도의 3-NT 7 , 17 , 18 의 측정을 위해서는 문헌에보고 된 LC-MS / MS 방법의 사용성이 향상되어야하고 고 처리량 응용 12 , 13 , 17 , 19에 대해서는 상대적으로 긴 처리 시간을 단축해야합니다 .
또한, 임상 적용을 고려할 때, 사용 된 생물학적 기질이 중요한 역할을한다. 가능한 경우 쉽고 저렴해야하며 가능한 경우 비 침습적이어야합니다 20 , 21 , 22 . 문헌에서 전통적으로 사용 된 혈장은 임상 적으로 바람직한 매트릭스가 아니므로, 비 침습적이고 비용 효과가있는 소변을 이용하는 방법론이 필요하다.
rel 개발을위한 몇 가지 시도iable 및 특정 LC-MS / MS 방법은 소변 9 , 10 , 11을 사용하여 이루어졌습니다. 그러나, 그들은 모두 임상 적 사용을 위해 선택적이고, 신뢰할 만하 며, 효율적이지 못하다. 3 NT 분석을위한 샘플 정리 등과 같은 전통적인 역상 카트리지 (C18 타입)를 사용하여 지배적 인 SPE의 효과는 의문을 제기하고 강력한 양이온 교환의 순차적 인 SPE (SCX)와 역상 C18-OH 6 제안되었다되었습니다 7 , 19 . 한 최근 개발 된 LC-MS / MS 방법 3- NT (23)의 분석을위한 설명서 C18 SPE, 예비 고압 액체 크로마토 그래피 (HPLC), 온라인 SPE의 다단계 정제 공정을 이용했다. 이 방법은 0.041 nM의 LLOQ로 임상 목적에 충분히 민감했지만, 정화 과정은 집중적이고 지루하고 requi적색 3 mL의 소변. 높은 처리량에 대한 가능성을 제한합니다. 분자 임프린트 폴리머 정리 프로세스 (14)의 효율을 개선하기 위해 SPE 흡착제로서 사용되었지만, 생성 된 LLOQ (0.7 ㎍ / mL)의 임상 검체 충분히 낮은 아니었다. 또 다른 방법은 0.022 nM 24 의 검출 한계 (LOD)를 달성하기 위해 샘플 정화를 위해 2 차원 (2D) LC-MS / MS 및 면역 친화 크로마토 그래피가 필요했습니다. 이러한 모든 방법들이 3-NT의 평가에서 진전을 보였지만 임상 적용에 필요한 민감성, 신뢰성 및 효율성을 달성 한 것은 없습니다.
무료 3-NT의 병리 및 임상 설정에서 산화 스트레스의 바이오 마커의 역할을 조사하기 위해, 우리는 높은 처리량 임상 적용 25 수 있도록, 간단하고 효율적 정확하고 정밀한하는 방법을 개발했다. 소형화 된 혼합 모드 양이온 엑시드유도체 화, 증발 및 2D-LC를 필요로하는 기존 방법에서 나타나는 단점을 우회하여 단일 추출에서 3-NT의 간단하고 효과적인 시료 정화 및 농축을 달성하기 위해 hange (MCX) 96-well 추출 마이크로 플레이트가 구현되었습니다. 0.01 % HCOOH가 첨가 된 액체 크로마토 그래피는 신속한 사이클 시간으로 향상된 신호 응답을 제공합니다. 선택성은 3-NT의 선택적 용리 및 3-NT 및 내부 표준 (IS) 모두에 대한 MRM 전이의 사용을위한 약한 NH 4 OAc 용출 용액의 적용을 통해 더욱 향상되었다. 기질 효과는 정량화를 위해 선호되는 13 C- 동위 원소 IS의 감소 된 양을 사용함으로써 보상되었다. 이 방법론의 출현과 함께 연구원 및 임상의는 임상 적 상태에서 3-NT의 역할을 검증하고 산화 스트레스의 영향을 더 탐구 할 수있을 것이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 소변 샘플의 내인성 자유 3-NT에 대한 문헌에서 이전에보고 된 농도의 상당한 변화는 이용 가능한 분석 8 , 9 , 10 , 11 과 관련된 방법 론적 문제점을 나타낸다. 인간 소변에서 3-NT의 낮은 기본 수준을 정확하게 결정하는 것은 시료 준비 및 LC-MS / MS 분석을위한 특별한 예방 조치가 필요한 까다로운 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 Scott Haard와 Abigail Marinack에게이 작업에 대한 일반적인 지원과 조정에 대해 인정할 것입니다.
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
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