Integración de la Extracción de Fase Sólida Miniaturizada y la Detección de LC-MS / MS de 3-Nitrotirosina en Orina Humana para Aplicaciones Clínicas
Summary
Se desarrolló un método selectivo y sensible de espectrometría de masa tándem de cromatografía líquida (LC-MS / MS) acoplado con una extracción en fase sólida eficiente en una microplaca de 96 pocillos de intercambio catiónico de modo mixto (MCX) para la medición de 3-nitrotirosina libre 3-NT) en la orina humana con alto rendimiento, que es adecuado para aplicaciones clínicas.
Abstract
La 3-nitrotirosina libre (3-NT) ha sido ampliamente utilizada como un posible biomarcador para el estrés oxidativo. Los niveles aumentados de 3-NT han sido reportados en una amplia variedad de condiciones patológicas. Sin embargo, los métodos existentes carecen de la suficiente sensibilidad y / o especificidad necesarias para medir el bajo nivel endógeno de 3-NT confiablemente y son demasiado engorrosos para aplicaciones clínicas. Por lo tanto, la mejora analítica es urgentemente necesario para cuantificar con precisión los niveles de 3-NT y verificar el papel de 3-NT en condiciones patológicas. Este protocolo presenta el desarrollo de una nueva cromatografía líquida de espectrometría de masa tándem (LC-MS / MS) de detección combinado con una extracción de fase sólida miniaturizada (SPE) para la medición rápida y precisa de 3-NT en la orina humana como un biomarcador no invasivo Para el estrés oxidativo. SPE utilizando una placa de 96 pocillos marcadamente simplificado el proceso mediante la combinación de la limpieza de muestras y el enriquecimiento de analito sin derivatización tedioso y etapas de evaporación, La reducción del consumo de disolventes, la eliminación de residuos, el riesgo de contaminación y el tiempo total de procesamiento. El empleo de acetato de amonio 25 mM (NH 4 OAc) a pH 9 como la solución SPE elución mejora sustancialmente la selectividad. La respuesta de la señal de espectrometría de masas se mejoró mediante el ajuste de las transiciones de monitorización de reacción múltiple (MRM). El uso de HCOOH al 0,01% como aditivo en una columna de pentafluorofenilo (PFP) (150 mm x 2,1 mm, 3 mu m) mejoró la respuesta de señal 2,5 veces más y acortó el tiempo total de ejecución a 7 min. Se alcanzó un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de 10 pg / mL (0,044 nM), lo que representa una mejora significativa de la sensibilidad con respecto a los ensayos descritos. Este método simplificado, rápido, selectivo y sensible permite procesar dos placas de muestras de orina (n = 192) en un período de 24 h. Teniendo en cuenta el rendimiento analítico notablemente mejorado y el muestreo de orina no invasivo y barato, el ensayo propuesto es beneficioso para las pruebas preclínicas y clínicasestudios.
Introduction
Los efectos del estrés oxidativo en la presentación clínica se han puesto en primer plano en los últimos años 1 . Uno de los biomarcadores que se están explorando es la 3-nitrotirosina (3-NT), un producto estable al final formado cuando las especies reactivas del nitrógeno (RNS) interactúan con la tirosina, un precursor del neurotransmisor de la catecolamina. Aunque 3-NT puede tener valor clínico como un biomarcador para RNS in vivo, los cambios sustanciales de las propiedades y funciones de la tirosina puede afectar negativamente a las correspondientes proteínas y funciones celulares [ 1 , 2] . Investigaciones emergentes han sugerido que el 3-NT puede desempeñar un papel importante en las condiciones inflamatorias 3 , los trastornos neurodegenerativos 4 , 5 , las enfermedades cardiovasculares 6 y la diabetes 7 , así como las condiciones relacionadas con el estrés oxidativo. Sin embargo, estos obseLas revisiones se basan en resultados de metodologías que carecen de sensibilidad y / o selectividad 8 , 9 , 10 , 11 . Los enormes rangos de concentración de 3-NT para las muestras biológicas previamente reportadas en la literatura revelan que se asocian serios problemas analíticos con estos ensayos y se necesita una mejora técnica para cuantificar con precisión los niveles de 3-NT y verificar su papel en la patología de estas condiciones .
La cuantificación de 3-NT libre en matrices biológicas presenta un reto especial para el hombre y el instrumento 8 , 9 , 10 , 11 . En primer lugar, el nivel de traza de 3-NT endógeno requiere una detección ultra-sensible; Segundo, la existencia de numerosos análogos estructuralmente similares, especialmente la tirosina, que está presente enGran exceso, requiere un alto grado de selectividad; Tercero, la formación artefactual de NT-NT por nitración de tirosina con nitrato y nitrito omnipresentes requiere consideración especial durante la preparación de la muestra para evitar una falsa sobrestimación del 3-NT.
Entre una amplia variedad de metodologías empleadas para medir el 3-NT, MS / MS ha sido considerado el método estándar de oro debido a su superior sensibilidad y selectividad 11 , 12 , 13 , 14 . La cromatografía de gases (GC) acoplada MS / MS ofrece la mejor sensibilidad, sin embargo, los pasos indispensables de derivatización de la muestra son demasiado tediosos y requieren mucho tiempo para ser eficientes para la utilidad clínica 15 , 16 . LC-MS / MS no requiere derivatización de muestras complejas, lo que la convierte en la opción más prometedora. Sin embargo, hay varios obstáculos a superar como elNsitivity de los métodos de LC-MS / MS reportados en la literatura necesita mejorar para la medición de 3-NT 7 , 17 , 18 y el tiempo de respuesta relativamente largo debe ser acortado para aplicaciones de alto rendimiento 12 , 13 , 17 , 19 .
Además, al considerar las aplicaciones clínicas, la matriz biológica utilizada desempeña un papel importante. Debe ser fácil y barato de obtener y no invasivo si es posible 20 , 21 , 22 . El plasma, la muestra tradicionalmente utilizada en la literatura, no es una matriz clínicamente deseable, por lo que se buscó una metodología que utilizara orina que no sea invasiva y que tuviera un costo efectivo.
Varios intentos de desarrollar relSe han realizado metodologías LC-MS / MS específicas y específicas con la orina 9 , 10 , 11 . Sin embargo, todos ellos han dejado de ser selectivos, fiables o suficientemente eficaces para el uso clínico. Se ha cuestionado la efectividad de la SPE predominante con cartucho tradicional de fase inversa (tipo C18) como limpieza de muestra para el análisis de 3-NT y se ha propuesto una SPE secuencial de intercambio catiónico fuerte (SCX) y C18-OH de fase inversa 6 , 7 , 19 . Un método recientemente desarrollado de LC-MS / MS utilizó un proceso de purificación de etapas múltiples de SPE C18 manual, cromatografía líquida de alta presión preparativa (HPLC) y SPE en línea para análisis de 3-NT 23 . Aunque este método fue lo suficientemente sensible para fines clínicos, con un LLOQ de 0,041 nM, el proceso de limpieza fue intensivo y tedioso y requiRojo 3 mL de orina, lo que limita su viabilidad para el alto rendimiento. Se empleó un polímero impreso molecularmente como sorbente SPE para mejorar la eficiencia del proceso de limpieza 14 , pero el LLOQ resultante (0,7 μg / ml) no era lo suficientemente bajo como para muestras clínicas. Otro método requirió LC-MS / MS bidimensional (2D) y cromatografía de inmunoafinidad para la limpieza de muestras con el fin de alcanzar un límite de detección (LOD) de 0,022 nM [ 24] . Si bien todos estos métodos han hecho avances en la evaluación de 3-NT, ninguno ha logrado la sensibilidad, fiabilidad y eficiencia necesarias para las aplicaciones clínicas.
Con el fin de investigar la patología de 3-NT libre y su papel como un biomarcador de estrés oxidativo en clínicas, hemos desarrollado una metodología que es simple, eficiente, precisa y precisa, lo que permite de alto rendimiento aplicaciones clínicas 25 . Una catión de modo mixto miniaturizado excHange (MCX) de 96 pocillos se realizó una microplaca de extracción para lograr una simple y efectiva limpieza de muestras y enriquecimiento de 3-NT en una sola extracción, superando los inconvenientes observados en los métodos existentes que requieren derivatización, evaporación y 2D-LC. La cromatografía líquida con HCOOH al 0,01% como aditivo en fase móvil ofreció una respuesta de señal mejorada con un tiempo de ciclo rápido. La selectividad se mejora aún más mediante la aplicación de un NH 4 solución de elución suave OAc para la elución selectiva de 3-NT, y el uso de transición MRM para ambos 3-NT y el patrón interno (IS). El efecto de la matriz se compensa mediante el uso de una cantidad reducida de un 13 isotópica C marcado preferido es para la cuantificación. Con el advenimiento de esta metodología, los investigadores y los médicos serán capaces de verificar el papel de 3-NT en las condiciones clínicas y seguir explorando el impacto del estrés oxidativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las variaciones sustanciales en las concentraciones previamente reportadas en la literatura para el 3-NT libre endógeno en muestras de orina humana revelan problemas metodológicos asociados con los ensayos disponibles 8 , 9 , 10 , 11 . La determinación exacta del bajo nivel basal de 3-NT en la orina humana sigue siendo una tarea difícil que requiere precauciones especiales para la preparac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocerían a Scott Howard y Abigail Marinack por el apoyo general y la coordinación de este trabajo.
Materials
| 3-Nitro-L-tyrosine | Sigma | N7389-5g | |
| 3-Nitro-L-tyrosine-13C9 | Sigma | 652296-5.0mg | |
| Mass Spec Gold Urine | Golden West Biologicals | MSG 5000-1L | |
| Oasis MCX 96-well µElution plate | Waters | 186001830BA | |
| 2mL 96 well collection plate | Phenomenex | AH0-7194 | |
| 96 positive processor | Waters | 186005521 | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol | Sigma | 14262-2L | |
| LC-MS Ultra CHROMASOLV water | Sigma | 14263-2L | |
| Formic acid for mass spectrometry | Sigma | 94318-50ML-F | |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma | 338818-1L | |
| Ultra PFP propyl columns | Restek | 9179362 | |
| 5500 Triple quad | AB Sciex | / | Contact manufacture for more detail |
| UFLC-XR | Shimadzu | / | Contact manufacture for more detail |
| Integra 400 Plus | Roche | / | Urinary Creatinine Jaffé Gen 2 method |
| LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial | Waters | 600000751CV | |
| LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial | Waters | 186000384C | |
| 5 mL transport tube | Phenix | TT-3205 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Crystalgen | 23-2266 | |
| eLine electronic pipette | Sartorius | 730391 | |
| Microfuge centrifuge | Beckman Coulter | A46474 | |
| OHAUS balance | Kennedy Scales, inc. | 735 | |
| Vortex mixer | Bernstead Thermolyne | M16715 |
References
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