Summary

Le préconditionnement hypoxique des cellules progénitrices dérivées de la moelle en tant que source pour la génération de cellules Schwann mûres

Published: June 14, 2017
doi:

Summary

Les cellules stromales de la moelle (MSC) avec potentiel neuronal existent dans la moelle osseuse. Notre protocole enrichit cette population de cellules par un préconditionnement hypoxique et les dirige ensuite pour devenir des cellules Schwann matures.

Abstract

Ce manuscrit décrit un moyen d'enrichir les progéniteurs neuronaux de la population de cellules stromales de la moelle (MSC) et ensuite de les diriger vers le sort de la maladie de Schwann mûr. Nous avons soumis les MSC de rat et humains à des conditions hypoxiques transitoires (1% d'oxygène pendant 16 h), suivies d'une expansion sous forme de neurosphères sur un substrat à faible adhérence avec un supplément de facteur de croissance épidémique (EGF) / supplément de fibroblaste basique (bFGF). Les neuro-sphères ont été ensemencées sur du plastique de culture de tissu revêtu de poly-D-lysine / laminine et cultivées dans un cocktail gliogénique contenant la β-Hereguline, le bFGF et le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) pour générer des cellules de type Schwann (SCLC). Les SCLC ont été dirigés vers l'engagement du devenir par coculture pendant 2 semaines avec des neurones de ganglions de racines dorsales purifiés (DRG) obtenus à partir de rats Sprague Dawley enceintes E14-15. Les cellules Schwann d'âge mûr démontrent une persistance dans l'expression de S100β / p75 et peuvent former des segments de myéline. Les cellules générées de cette manière ont un potentielPplications dans la transplantation de cellules autologues après une lésion de la moelle épinière, ainsi que dans la modélisation de la maladie.

Introduction

La transplantation de progéniteurs neuronaux et leurs dérivés se révèle prometteuse en tant que stratégie de traitement suite à une lésion du nerf traumatique 1 , 2 et une neurodégénérescence 3 , 4 . Avant l'application clinique, il est essentiel d'assurer: i) une méthode pour accéder et développer une source autologue de cellules souches / progénitrices et ii) un moyen de les diriger vers des types de cellules adultes pertinents 3 . Notre intérêt pour la thérapie cellulaire pour la lésion de la moelle épinière nous a permis de rechercher une source cellulaire autologue robuste de progéniteurs neuronaux à partir de tissus adultes.

Une sous-population de MSC provient de la crête neurale et est facilement accessible à partir de la cavité de la moelle. Ces cellules sont des progéniteurs neuronaux qui peuvent générer des neurones et de la glie 5 . Les modèles animaux d'ischémie cérébrale démontrent que l'hypoxie favorise le prolapsus L'infiltration et la multiplicité des progéniteurs neurologiques dans le cerveau 6 . Ceci a servi de base à l'utilisation du préconditionnement hypoxique comme moyen d'expansion sur les progéniteurs neurologiques dérivés de la moelle.

La transplantation de cellules de Schwann dans la moelle épinière lésée favorise la régénération 2 . Les SCLC peuvent être générés à partir de MSC au moyen de suppléments avec des facteurs gliogéniques ( p. Ex., Β-Heregulin, bFGF et PDGF-AA) mais démontrent une instabilité phénotypique. Lors du retrait des facteurs de croissance, ils reviennent à un phénotype de type fibroblaste 7 . L'instabilité phénotypique est indésirable dans la transplantation cellulaire en raison du risque de différenciation aberrante et de carcinogenèse. Comme les précurseurs de cellules de Schwann sont associés à des faisceaux d'axones dans le nerf périphérique embryonnaire 8 , nous avons été conduits à des SCLC de coculture avec des neurones DRG embryonnaires purifiés 7 ,Ass = "xref"> 9. Les cellules Schwann matures résultantes sont engagées et démontrent une fonction in vitro 7 , 9 et 10 in vivo .

Notre protocole pour l'enrichissement des progéniteurs neuronaux des MSC est simple et efficace et entraîne une augmentation du nombre de cellules pour les tests ultérieurs. La dérivation des cellules Schwann engagées par le biais de la plate-forme coculture permet l'étude de la différenciation gliale et la génération de cellules Schwann stables et fonctionnelles pour une application clinique potentielle.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées en stricte conformité avec le Guide NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et approuvé par le Comité sur l'utilisation des animaux vivants pour l'enseignement et la recherche, la Faculté de médecine Li Ka Shing, l'Université de Hong Kong. Des échantillons humains de moelle osseuse ont été obtenus à partir de la crête iliaque de donneurs sains après avoir obtenu leur consentement éclairé. Les protocoles…

Representative Results

Un aperçu des étapes clés de notre protocole est illustré à la figure 1 . En résumé, les MSC de rat et humains sont sélectionnés par adhérence au plastique de culture tissulaire. Les MSC élargis sont préconditionnés avec une hypoxie et sont ensuite soumis à des conditions de formation de la neurosphère. Les neuro-sphères sont plaquées et autorisées à se différencier en SCLC. Les SCLC sont cultivés avec des neurones DRG purifiés pour gé…

Discussion

Il est essentiel de préserver la «tige» des MSC avant l'enrichissement des progéniteurs neuronaux par un préconditionnement hypoxique et une culture de la neurosphère. De notre expérience, les MSC multipotents peuvent être identifiés de manière fiable par leur morphologie allongée de type fibroblaste. En revanche, les MSC qui ont adopté une morphologie quadrangulaire plus aplatie, avec des fibres de stress cytosquelettiques proéminentes, n'admettent pas facilement le devenir des cellules neurales et…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent remercier le Dr Nai-Sum Wong d'avoir fourni l'appareil de chambre hypoxique et Mme Alice Lui pour le soutien technique.

Materials

αMEM Sigmaaldrich M4526
DMEM/F12 Thermofisher scientific 12400-024
Neurobasal medium Thermofisher scientific 21103-049
FBS Biosera FB-1280/500
B27 Thermofisher scientific 17504-001
Epidermal growth factor (EGF) Thermofisher scientific PHG0313
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech 100-18B/100UG
Nerve growth factor (NGF)  Millipore NC011
Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) Peprotech 100-13A
Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) Millipore 01-201
Uridine Sigmaaldrich U3003
5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) Sigmaaldrich F0503
Poly-D-lysine (PDL) Sigmaaldrich P7886-1G
Laminin Thermofisher scientific 23017015
GlutaMAX Thermofisher scientific 35050061
Penicillin / streptomycin (P/S) Thermofisher Scientific 15140-122
TrypLE Express Thermofisher Scientific 12604-013
10 cm plate for adherent culture TPP 93100 Used for selection of MSCs by tissue culture adherence
6-well plate for adherent culture TPP 92006 Used for expansion of MSCs following passaging
UltraLow 6-well plate for non-adherent culture Corning 3471 Used for neural progenitor enrichment
anti-human CD90(Thy-1) BD Biosciences 555593
anti-human CD73 BD Biosciences 550256
anti-human/rat STRO-1 R&D Systems MAB1038
anti-human nestin R&D Systems MAB1259
anti-human CD45 BD Biosciences 555480
anti-rat CD90(Thy-1) BD Biosciences 554895
anti-rat CD73 BD Biosciences 551123
anti-rat nestin BD Biosciences MAB1259
anti-rat CD45 BD Biosciences 554875
Anti-S100β Dako Z031101
Anti-p75 Millipore MAB5386
Anti-GFAP Sigmaaldrich G3893
Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) Covance MMS-435P
Anti-Human nuclei Millipore MAB1281
Hypoxia chamber Billups-Rothenberg MIC-101
HEPES buffer Sigmaaldrich H4034-100G

References

  1. Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
  2. Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
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Cite This Article
Tsui, Y., Mung, A. K., Chan, Y., Shum, D. K., Shea, G. K. Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells. J. Vis. Exp. (124), e55794, doi:10.3791/55794 (2017).

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