Precondizionamento ipossico delle cellule progenitori derivate dal midollo osseo come fonte per la generazione di cellule Schwann mature
Summary
Le cellule stromali del midollo (MSC) con potenziale neurale esistono all'interno del midollo osseo. Il nostro protocollo arricchisce questa popolazione di cellule attraverso precondizionamento ipossico e poi li indirizza a diventare cellule Schwann mature.
Abstract
Questo manoscritto descrive un mezzo per arricchire i progenitori neurali dalla popolazione delle cellule stromali del midollo (MSC) e quindi di indirizzarli al destino cellulare di Schwann. Abbiamo sottoposto a MSC topi e umani situazioni ipossiche transitorie (ossigeno 1% per 16 h) seguito da espansione come neurosfere su substrato di basso affinamento con fattore di crescita epidermica (EGF) / fattore di crescita fibroblastico base (bFGF). Le neurosfere sono state seminate in plastica di coltura tissutale rivestita con poli-D-lisina e laminina e coltivate in un cocktail gliogenico contenente β-Heregulin, bFGF e fattore di crescita derivato da piastrine (PDGF) per generare cellule simili a cellule Schwann (SCLC). Gli SCLC sono stati indirizzati verso l'impegno di destino mediante cocultura per 2 settimane con neuroni gangliali radici dorsali purificati (DRG) ottenuti da E14-15 ratti incinte Sprague Dawley. Le cellule Schwann mature dimostrano persistenza nell'espressione S100β / p75 e possono formare segmenti di mielina. Le celle generate in questo modo hanno potenziale aPplicazioni nel trapianto di cellule autologhe dopo lesioni del midollo spinale, così come nella modellazione delle malattie.
Introduction
Il trapianto di progenitori neurali e dei loro derivati dimostra la promessa come strategia di trattamento a seguito di lesioni traumatiche 1 e 2 e neurodegenerazione 3 , 4 . Prima dell'applicazione clinica, è essenziale assicurare: i) un metodo per accedere e espandere ad una fonte autologa di cellule staminali / progenitori e ii) un mezzo per indirizzarli a tipi di cellule mature, rilevanti 3 . Il nostro interesse per la terapia cellulare per lesioni del midollo spinale ci ha portato a cercare una fonte di cellule autologhe robuste e robuste di progenitori neurali dai tessuti adulti.
Una sottopopolazione di MSC provengono dalla cresta neurale e sono facilmente accessibili dalla cavità del midollo. Queste cellule sono progenitori neurali che possono generare neuroni e glia 5 . I modelli animali di ischemia cerebrale dimostrano che l'ipossia promuove la prol Iferazione e multipotenza di progenitori neurali all'interno del cervello 6 . Questa è stata la base per l'utilizzo di precondizionamento ipossico come mezzo di espansione su progenitori neurali derivanti dal midollo.
Il trapianto di cellule Schwann nel midollo spinale favorisce la rigenerazione 2 . Le SCLC possono essere generate da MSC mediante l'integrazione con fattori gliogenici (β-Heregulin, bFGF e PDGF-AA) ma dimostrano instabilità fenotipica. Al ritiro dei fattori di crescita, essi ritornano a un fenotipo tipo fibroblasto 7 . L'instabilità fenotipica è indesiderabile nel trapianto cellulare a causa del rischio di differenziazione aberrante e di carcinogenesi. Poiché i precursori di cellule di Schwann sono associati a fasci dell'assone all'interno del nervo periferico embrionale 8 , ci sono stati condotti SCLC di coculture con neuroni embrionali DRG purificati 7 ,Ass = "xref"> 9. Le cellule Schwann mature risultanti sono fate-committed e dimostrano la funzione in vitro 7 , 9 e in vivo 10 .
Il nostro protocollo per l'arricchimento dei progenitori neurali da MSC è semplice ed efficiente e porta ad un aumento del numero di cellule per i successivi dosaggi. La derivazione di cellule Schwann fatte tramite destino attraverso la piattaforma di coculture consente lo studio della differenziazione gliale e la generazione di cellule Schwann stabili e funzionali per una possibile applicazione clinica.
Protocol
Representative Results
Discussion
È fondamentale preservare la "gamba" dei MSC prima dell'arricchimento dei progenitori neurali attraverso precondizionamento ipossico e cultura della neurosfera. Dalla nostra esperienza, MSC multipotenti possono essere identificati in modo affidabile dalla loro morfologia simile a fibroblasti. Al contrario, i MSC che hanno adottato una morfologia piu 'appiattita e quadrangolare, con fibre di stress sospettose prominenti, non adottano facilmente i destini delle cellule neurali e vanno scartate. In gener…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero riconoscere il dottor Nai-Sum Wong per aver fornito l'apparato della camera di ipossia e la signora Alice Lui per il supporto tecnico.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
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