Hypoxic Preonditioning של תאים יליד מארו נגזר כמקור לדור של תאים שוואן בוגרת
Summary
תאים מוחיים סטרומליים (MSC) עם פוטנציאל עצבי קיימים בתוך מוח העצם. הפרוטוקול שלנו מעשיר אוכלוסייה זו של תאים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ולאחר מכן מפנה אותם להפוך לתאי Schwann בוגרת.
Abstract
כתב יד זה מתאר אמצעי להעשרתם של אבות עצביים מאוכלוסיית תאי החלב (MSC) ולאחר מכן להפנותם אל גורל התא הבוגר של שוואן. ערכנו חולדות וחולי סרטן אנושיים לתנאים היפוקסיים חולפים (חמצן של 1% ל -16 שעות), ולאחר מכן התרחבות כנוירוספרה על מצע נמוך עם גורם גדילה של אפידרמיס (EGF) / תוספת גורמי גידולי פיברובלסטים בסיסיים (bFGF). Neurospheres היו seeded על פולי-D- ליזין / laminin מצופה רקמה תרבות פלסטיק ו מתורבת בקוקטייל gliogenic המכיל β-Heregulin, bFGF, ו טסיות הנגזרות גורם הצמיחה (PDGF) לייצר תאים דמויי תא שוואן (SCLCs). SCLCs היו מופנים למחויבות הגורל באמצעות coculture במשך 2 שבועות עם נוירונים השורש הגבי מטוהרים (DRG) נוצרים המתקבלים E14-15 הרות חולדה Sprague Dawley. תאים בשלה שוואן להוכיח התמדה ביטוי S100β / p75 ויכול ליצור קטעי myelin. תאים שנוצרו באופן זה יש פוטנציאל אPplications ב השתלת תאים אוטולוגיים בעקבות פגיעה בחוט השדרה, כמו גם דוגמנות המחלה.
Introduction
השתלת אבות עצביים ונגזרותיהם מדגימה את ההבטחה כאסטרטגיה טיפולית בעקבות פגיעה עצבית טראומטית 1 , 2 ונוירוגנרטיון 3 , 4 . לפני היישום הקליני, זה חיוני כדי להבטיח: א) שיטה לגישה והרחבה על מקור אוטולוגי של גזע / תאים אב ו 2) אמצעי לכוון אותם סוגי תאים רלוונטיים, בוגרת 3 . ההתעניינות שלנו בטיפול בתאי פציעה בחוט השדרה הובילה אותנו לחפש מקור תא אוטולוגי חזק ואבולוצי של אבות עצביים ברקמות של מבוגרים.
תת אוכלוסיות של MSC מקורן בכף עצבי, והוא נגיש בקלות מחלל המפרק. תאים אלה הם אבות עצביים שיכולים ליצור נוירונים וגליה 5 . מודלים של בעלי חיים של איסכמיה מוחית מראים כי היפוקסיה מקדמת את ההרגעה Iferation ו multipotency של אבות עצביים בתוך המוח 6 . זה היה הבסיס לשימוש התנאי היפוקסי כאמצעי להרחבת על אבות עצביים הנגזרים על מוח.
השתלת תאי Schwann לתוך חוט השדרה הפצוע מקדם התחדשות 2 . SCLCs ניתן לייצר MSCs באמצעות תוספת עם גורמים gliogenic ( כלומר, β-Heregulin, bFGF, ו PDGF-AA), אבל להפגין יציבות פנוטיפית. עם הנסיגה של גורמי גדילה, הם לחזור פנוטיפ דמוי fibroblast 7 . אי-יציבות פנוטיפית אינה רצויה בהשתלות תאים בשל הסיכון של הבחנה חריגה וסרטן. כמו מבשרי התא Schwann קשורות עם צרורות האקסון בתוך העצב ההיקפי עובריים 8 , הובילו cLCulture coculture עם נוירונים DRG מטוהרים עובריים 7 ,התחת = "xref"> 9. תאים בוגרת שוואן בשלבים הם גורל מחויבים להפגין פונקציה במבחנה 7 , 9 ו in vivo 10 .
הפרוטוקול שלנו להעשרת אבות עצביים מ MSC הוא פשוט ויעיל ותוצאות גידול במספר התא עבור מבחני הבאים. הגזירה של תאי גורן מחויבים באמצעות פלטפורמת coculture מאפשר לימוד של הבדל גלייה ועל הדור של תאים שוואן יציבה ופונקציונלית עבור יישומים קליניים פוטנציאליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זה חיוני כדי לשמר את "גזע" של MSCs לפני העשרה של אבות עצביים באמצעות תנאים מוקדמים היפוקסי ותרבות neurosphere. מניסיוננו, MSCs ריבוי יכול להיות מזוהה באופן מהימן על ידי מורפולוגיה fibroblast שלהם מוארך כמו. לעומת זאת, MSCs אשר אימצו מורפולוגיה מרובעת יותר, מרובעת, עם סיבי הלחץ הבו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים היו רוצים להודות ד"ר Nai-Sum וונג על מתן המנגנון קאמרית היפוקסיה וגברת אליס לואי עבור התמיכה הטכנית.
Materials
| αMEM | Sigmaaldrich | M4526 | |
| DMEM/F12 | Thermofisher scientific | 12400-024 | |
| Neurobasal medium | Thermofisher scientific | 21103-049 | |
| FBS | Biosera | FB-1280/500 | |
| B27 | Thermofisher scientific | 17504-001 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Thermofisher scientific | PHG0313 | |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | 100-18B/100UG | |
| Nerve growth factor (NGF) | Millipore | NC011 | |
| Platelet-derived growth factor-AA (PDGF-AA) | Peprotech | 100-13A | |
| Heregulin beta-3, EGF domain (β-Her) | Millipore | 01-201 | |
| Uridine | Sigmaaldrich | U3003 | |
| 5-Fluro-2' – deoxyuridine (FDU) | Sigmaaldrich | F0503 | |
| Poly-D-lysine (PDL) | Sigmaaldrich | P7886-1G | |
| Laminin | Thermofisher scientific | 23017015 | |
| GlutaMAX | Thermofisher scientific | 35050061 | |
| Penicillin / streptomycin (P/S) | Thermofisher Scientific | 15140-122 | |
| TrypLE Express | Thermofisher Scientific | 12604-013 | |
| 10 cm plate for adherent culture | TPP | 93100 | Used for selection of MSCs by tissue culture adherence |
| 6-well plate for adherent culture | TPP | 92006 | Used for expansion of MSCs following passaging |
| UltraLow 6-well plate for non-adherent culture | Corning | 3471 | Used for neural progenitor enrichment |
| anti-human CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 555593 | |
| anti-human CD73 | BD Biosciences | 550256 | |
| anti-human/rat STRO-1 | R&D Systems | MAB1038 | |
| anti-human nestin | R&D Systems | MAB1259 | |
| anti-human CD45 | BD Biosciences | 555480 | |
| anti-rat CD90(Thy-1) | BD Biosciences | 554895 | |
| anti-rat CD73 | BD Biosciences | 551123 | |
| anti-rat nestin | BD Biosciences | MAB1259 | |
| anti-rat CD45 | BD Biosciences | 554875 | |
| Anti-S100β | Dako | Z031101 | |
| Anti-p75 | Millipore | MAB5386 | |
| Anti-GFAP | Sigmaaldrich | G3893 | |
| Anti-Class III-beta tubulin (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| Anti-Human nuclei | Millipore | MAB1281 | |
| Hypoxia chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | |
| HEPES buffer | Sigmaaldrich | H4034-100G |
References
- Wiliams, R. R., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?. Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus. Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).
- Lindvall, O., Kokaia, Z. Stem cells in human neurodegenerative disorders–time for clinical translation?. J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).
- Terzic, D., et al. Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells. Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).
- Takashima, Y., et al. Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation. Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).
- Felling, R. J., et al. Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia. J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).
- Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment–a prerequisite for remyelination therapy. Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. The origin and development of glial cells in peripheral nerves. Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).
- Mung, K. L., et al. Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146 (2016).
- Ao, Q., et al. The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells. Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).
- Tondreau, T., et al. Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential. Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).
- Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy. J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).
- Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment. J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).
