संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल के पोत जनरेशन को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक उपन्यास स्तनधारी फैट पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक
Summary
यह काम स्तन वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन के माध्यम से संवहनी एंडोथिलियल स्टेम कोशिकाओं (वीजेएससी) के प्रसार, भेदभाव और पोत बनाने की क्षमता का आकलन करने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण को दर्शाता है, जिसके बाद माइक्रोस्कोपिक अवलोकन के लिए पूरे माउंट ऊतक की तैयारी होती है। विवो में वीजेएससी के व्यवहार की जांच करने के लिए एक वंशावली अनुरेखण रणनीति भी प्रस्तुत की गई है।
Abstract
एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसीएस) नाड़ी की वास्तुकला के मौलिक बिल्डिंग ब्लॉक हैं और समुचित पोत विकास और होमोस्टैसिस को सुनिश्चित करने के लिए नाड़ी विकास और रीमॉडेलिंग मध्यस्थता है। हालांकि, एंडोथेलियल वंशावली पदानुक्रम पर अध्ययन उपकरण के अभाव के कारण पहुंच हासिल करने के साथ-साथ सीधे विवो में अपने व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए मायावी रहते हैं। इस कमी को हल करने के लिए स्तन वसा पैड का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक नया ऊतक मॉडल विकसित किया गया है। स्तन ग्रंथि ज्यादातर प्रसवोत्तर चरणों में विकसित होती है, जिसमें यौवन और गर्भावस्था शामिल होती है, जिसके दौरान मजबूत उपकला प्रसार के साथ व्यापक संवहनी रीमॉडेलिंग होता है। स्तनधारी वसा पैड बढ़ते स्तन उपकला से अंतरिक्ष, मैट्रिक्स और अमीर एंजियोजेनिक उत्तेजना प्रदान करते हैं। इसके अलावा, स्तन वसा पैड पेरिटोनियल गुहा के बाहर स्थित हैं, जिससे उन्हें एक्सोजेनस कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का आकलन करने के लिए एक आसानी से सुलभ ग्राफ्टिंग साइट मिलती है। यह काम भी एक प्रभावकारिता का वर्णन करता हैविशेष रूप से vivo में नाड़ी endothelial स्टेम कोशिकाओं (वीजेएससी) की लक्षित आबादी लेबल करने के लिए फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चूहों के उपयोग से एनटी ट्रेसिंग दृष्टिकोण। बाद में ऊतक पूरे माउंट माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित इस वंश निशान विधि, लक्षित कोशिकाओं और उनके वंश की प्रत्यक्ष दृश्यता को सक्षम करती है, जिसके माध्यम से प्रसार क्षमता की मात्रा निर्धारित की जा सकती है और भेदभाव प्रतिबद्धता भाग्य-मैप हो सकती है। इन विधियों का इस्तेमाल करते हुए, वीओएससी को व्यक्त करने वाले बायोटोतेंट प्रोटीन सी रिसेप्टर (प्रोक्रेट) की आबादी हाल ही में कई संवहनी प्रणालियों में की गई है। प्रोक्र + + वीजेएस, नए ईसीएस और पेरिसिट दोनों को जन्म देते हुए, विकास के दौरान एंजियोजेनेसिस में योगदान, होमोस्टैसिस, और चोट की मरम्मत। कुल मिलाकर, यह पांडुलिपि एक नया स्तनमय वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन और विवो वंशावली अनुरेखण तकनीकों का वर्णन करता है जो कि वीजेएससी के स्टेम सेल गुणों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
विकास और होमोस्टेसिस के दौरान, संवहनी विकास और रीमॉडलिंग ईमानदारी से अंग विकास और मरम्मत के अनुसार होते हैं। एंजियोजेनेसिस पहले से मौजूद रक्त वाहिकाओं से नए जहाजों की पीढ़ी का वर्णन करता है और इन गतिशील नाड़ी परिवर्तनों की मध्यस्थता में एक प्रमुख बल माना जाता है। प्रत्येक रक्त वाहिका को एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की एक परत के साथ आंतरिक रूप से खड़ा किया जाता है, और वे जहाज की वास्तुकला की नींव प्रतीत होते हैं। लंबे समय के लिए, होमियोस्टासिस के दौरान ईसी पूल की भरपाई की जाने वाली तंत्र अस्पष्ट बनी रही और बहस यह थी कि संवहनी टर्नओवर परिपक्व ईसी प्रसार का परिणाम है या संवहनी स्टेम / पूर्वज सेल गतिविधियों का योगदान है या नहीं। प्रत्यक्ष शारीरिक सबूत की कमी के कारण, संवहनी एंडोथिलियल स्टेम सेल (वीजेएससी) की अस्तित्व और सेलुलर पहचान भी विवादास्पद रही।
स्टेम सेल व्यवहार को सत्यापित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सबसे आम दृष्टिकोणों में से एक ट्रांसप्लान हैग्रहणशील स्टेम कोशिकाओं को प्राप्तकर्ता चूहों में मिला। यह विधि विवो में अभ्यर्थी स्टेम कोशिकाओं की स्टेमनेस क्षमता को मापता है । प्रत्यारोपण सबसे पहले अस्थि मज्जा स्टेम कोशिकाओं 1 के अध्ययन के लिए लागू किया गया था, जो हेमेटोपोएटिक प्रणाली 2 के पदानुक्रमिक विशेषताओं की स्थापना में योगदान दिया था। एंडोथेलियल फील्ड में, एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स ( जैसे, मैटिगिल) प्लग को नीचे की तरफ के नीचे डाला जाता है जो कि प्रत्यारोपित ईसीएस के पोत निर्माण क्षमताओं को संबोधित करने के लिए इस्तेमाल किए गए विवो एंजियोजेनेसिस परख में एक मानक था । 3 डी संस्कृति प्रणालियों और प्रत्यारोपण में कॉलोनी गठन सहित कई प्रयोगात्मक विधियों ने संभावित ईसी पूर्वज / वीजेएससी जनसंख्या 3 , 4 , 5 , 6 का सुझाव दिया है। हालांकि, चूंकि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में एम्बेडेड ईसीएस अपेक्षाकृत से अलग हैंआसपास के ऊतक, यह प्रत्यारोपित कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का पूरी तरह से पता लगाने के लिए आवश्यक अनुकूल वातावरण प्रदान नहीं करता है। नतीजतन, मैट्रिक्स प्लग के भीतर निर्मित जहाजों को मुख्य रूप से केशिका-समान होते हैं और वे कार्यात्मक रूप से अपरिहार्य होते हैं।
स्तन ग्रंथि प्रसवोत्तर रूप से विकसित होती है, जिसमें यौवन और गर्भावस्था के दौरान होने वाली सबसे मजबूत वृद्धि होती है। पौष्टिक अवस्था में, स्तन उपकला तेजी से विस्तार से गुजरती है, पूरे स्तनमय वसा वाले पैड पर कब्जा करने के लिए, आसपास के नाड़ी संरचनाओं के कुशल रीमॉडेलिंग के साथ। इस प्रकार, स्तन ग्रंथि एंजिोजेनेसिस के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रदान करती है। यह बढ़ते स्तन उपकला से अंतरिक्ष, मैट्रिक्स और अमीर एंजियोजेनिक उत्तेजना प्रदान करता है और इसलिए बाहरी कोशिकाओं की एंजियोजेनिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक आदर्श ग्राफ्टिंग साइट है। इसके अलावा, स्तन वसा वाला पैड मेजबान परिसंचरण प्रणाली के साथ गठित बहिर्जात जहाजों को एकीकृत करने की अनुमति देता है, जिससे आगे बढ़ेगाएक्सेक्शनल मूल्यांकन और चमड़े के नीचे प्रत्यारोपण पर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करते हैं।
हालांकि इन विट्रो संवर्धन और प्रत्यारोपण assays सेल आबादी के उत्थान गुणों की जांच करने के लिए प्रभावी तरीका हैं, यह ज्ञात है कि ऐसे assays plasticity को उत्तेजित कर सकते हैं के रूप में कोशिकाओं को अपने मूल निवास से दूर ले जाया जाता है, और जब सेल से डिस्कनेक्ट कर रहे हैं तो परिवर्तन हो सकता है उनके शारीरिक परिवेश 7 इसलिए, सेल भाग्य के विवो सबूत में सीधा प्राप्त करना एंडोथेलियल आबादी के व्यवहार की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण दृष्टिकोण है।
आनुवंशिक भाग्य मानचित्रण ( अर्थात्, विवो वंशावली अनुरेखण में) VESCs की पहचान के लिए आवश्यक है और शरीर की प्रणाली में उनकी संपत्ति की जांच के लिए आवश्यक है, क्योंकि यह शारीरिक संदर्भ में विवो स्टेम कोशिका व्यवहार में प्रकट हो सकता है, और वास्तविक स्टेमनेस हो सकता है आकलन किया। वंशावली traciएनजी उम्मीदवार वीजेएस के दीर्घकालिक दृढ़ता ( यानी, आत्म-नवीकरण) के प्रत्यक्ष प्रमाण प्रदान करता है और मूल के ऊतक के लिए सेल प्रकार का उत्पादन करने की उनकी क्षमता ( यानी, भिन्नता शक्ति)।
इस प्रोटोकॉल में एक उपन्यास स्तनमय वसा पैड ट्रांसप्लांटेशन तकनीक और वीजेएससी की पोत उत्पादन क्षमता को देखने के लिए एक वंश अनुरेखण विधि का वर्णन किया गया है। इन तकनीकों को वर्तमान में उपलब्ध assays की कमियों पर काबू पाने और VESCs के स्टेम सेल गुणों का बेहतर मूल्यांकन करने का एक नया तरीका प्रदान करते हैं। ये दृष्टिकोण कुशल उपकरण हैं जिनका उपयोग ऐन्डोथेलियल आबादी के व्यवहार और पोत-निर्माण गुणों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, साथ ही रोग के वातावरण में संवहनी सेल शक्ति परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एंजियोजेनेस एसेसन नाड़ी गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं। माउस रेटिनल vasculature, जो पोस्टनेटिकल रूप से विकसित होता है, ने एंजियोजेनेसिस 12 का…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31530045 और 31371500 से YAZ, 31401245 से QCY), चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2014 सीबी 9 64800), चीनी अकादमी विज्ञान (XDB 1 9 000000 से YAZ), और चीनी सोसायटी ऑफ सेल बायोलॉजी (अर्ली कैरियर फेलोशिप टू क्यूसीवाई)
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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