تقنية زرع الثدي الثديية الرواية جديدة لتصور الجيل سفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية
Summary
هذا العمل يدل على نهج جديد لتقييم الانتشار، والتمايز، وإمكانية تشكيل السفينة من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) من خلال الثديية زرع لوحة الدهون تليها كامل جبل إعداد الأنسجة للمراقبة المجهرية. كما يتم عرض استراتيجية تتبع النسب للتحقيق في سلوك فيسكس في الجسم الحي .
Abstract
الخلايا البطانية (إكس) هي اللبنات الأساسية للهندسة المعمارية الأوعية الدموية والتوسط نمو الأوعية الدموية وإعادة عرض لضمان التنمية السليم السفينة والتوازن. ومع ذلك، لا تزال الدراسات على التسلسل الهرمي البطانة بعيد المنال بسبب عدم وجود أدوات للوصول وكذلك لتقييم مباشرة سلوكهم في الجسم الحي . لمعالجة هذا القصور، تم تطوير نموذج أنسجة جديدة لدراسة الأوعية الدموية باستخدام لوحة الدهون الثديية. الغدة الثديية تتطور في الغالب في مراحل ما بعد الولادة، بما في ذلك سن البلوغ والحمل، ويرافق خلالها انتشار ظهارة قوية عن طريق إعادة عرض الأوعية الدموية واسعة النطاق. منصات الثدي الثديية توفر مساحة، مصفوفة، والمحفزات وعائية غنية من ظهارة الثديية المتنامية. وعلاوة على ذلك، وتقع منصات الدهون الثديية خارج تجويف البريتوني، مما يجعلها موقع التطعيم يمكن الوصول إليها بسهولة لتقييم إمكانات وعائية للخلايا الخارجية. يصف هذا العمل أيضا فعاليةنت تتبع النهج باستخدام الفئران مراسل الفلورسنت لتسمية على وجه التحديد السكان المستهدفين من الخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) في الجسم الحي . هذه الطريقة تتبع النسب، إلى جانب الأنسجة اللاحقة المجهر كامل جبل، وتمكين التصور المباشر من الخلايا المستهدفة ونسلهم، والتي من خلالها يمكن قياس القدرة على التكاثر ويمكن أن يكون التزام التمايز مصير تعيينها. باستخدام هذه الأساليب، وقد تم مؤخرا تحديد عدد من البروتينات C مستقبلات البروتين (بروكر) معربا عن فيسكس في أنظمة الأوعية الدموية متعددة. بروكر + فيسكس، مما يؤدي إلى كل من إكس و بيريسيتس جديدة، وتساهم بنشاط في تكوين الأوعية أثناء التنمية والتوازن، وإصلاح الإصابات. عموما، هذه المخطوطة يصف جديد الثديية زرع لوحة الدهون وفي الجسم الحي تقنيات تتبع النسب التي يمكن استخدامها لتقييم خصائص الخلايا الجذعية من فيسكس.
Introduction
خلال التنمية والتوازن، ونمو الأوعية الدموية وإعادة عرض بأمانة تأخذ مكان وفقا لنمو الجهاز وإصلاحه. يصف الأوعية الدموية توليد سفن جديدة من الأوعية الدموية الموجودة من قبل، ويعتبر قوة رئيسية تتوسط هذه التغيرات الأوعية الدموية الحيوية. كل الأوعية الدموية هي مبطنة الداخلية مع طبقة من الخلايا البطانية (إكس)، ويبدو أنها أساس بنية السفينة. لفترة طويلة، والآلية التي من خلالها يتم تجديد تجمع المفوضية الأوروبية خلال التوازن لا تزال غير واضحة، وأثيرت الحجج حول ما إذا كان دوران الأوعية الدموية هو نتيجة للانتشار إيك ناضجة أو هو مساهمة أنشطة الخلايا الجذعية الأوعية الدموية / السلف. نظرا لعدم وجود أدلة فسيولوجية مباشرة، ووجود والهوية الخلوية للخلايا الجذعية البطانية الأوعية الدموية (فيسس) ظلت أيضا مثيرة للجدل.
واحدة من النهج الأكثر شيوعا المستخدمة للتحقق من سلوك الخلايا الجذعية هي من خلال ترانسبلانتاتيون من الخلايا الجذعية المفترضة في الفئران المتلقية. يقيس هذا الأسلوب إمكانات الجذعية من الخلايا الجذعية المرشحة في الجسم الحي. تم تطبيق زرع لأول مرة لدراسة الخلايا الجذعية نخاع العظم 1 ، والتي ساهمت في إنشاء الخصائص الهرمية للنظام المكونة للدم 2 . في مجال البطانية، وكان مصفوفة الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، ماتريجيل) المكونات المدرجة تحت الجلد تحت الجلد الجناح معيارا في الجسم الحي فحص الأوعية الدموية المستخدمة لمعالجة قدرات تكوين السفن من إكس المزروعة. وقد اقترح أساليب تجريبية متعددة، بما في ذلك تشكيل مستعمرة في نظم الثقافة 3D وزرع، المحتملين السلف الأوروبي / سكان فيسك 3 ، 4 ، 5 ، 6 . ومع ذلك، منذ إكس جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الغشاء القاعدي منفصلة نسبيا عنالأنسجة المحيطة بها، وهذا لا يوفر البيئة المتخصصة الأمثل المطلوبة لاستكشاف كامل إمكانات وعائية من الخلايا المزروعة. ونتيجة لذلك، فإن السفن التي تشكلت داخل قابس المصفوفة تكون في الغالب شبيهة بالشعرية، ولا يمكن قياسها وظيفيا.
الغدة الثديية تتطور بعد الولادة، مع النمو الأكثر قوة التي تحدث أثناء سن البلوغ والحمل. في مرحلة البلوغ، ظهارة الثديية يخضع التوسع السريع، لاحتلال كامل لوحة الدهون الثديية، يرافقه إعادة عرض كفاءة الهياكل الأوعية الدموية المحيطة بها. وبالتالي، فإن الغدة الثديية تقدم نموذجا ممتازا لدراسة الأوعية الدموية. أنه يوفر مساحة، مصفوفة، والمحفزات وعائية غنية من ظهارة الثديية المتنامية، وبالتالي هو موقع تطعيم مثالية لتقييم إمكانات وعائية للخلايا الخارجية. وبالإضافة إلى ذلك، لوحة الدهون الثديية يسمح للسفن الخارجية شكلت لدمج مع نظام الدورة الدموية المضيف، مما يتيح مزيد من وتقييم وظيفي ويمثل ميزة على زرع تحت الجلد.
على الرغم من أن في المختبر زراعة وفحوصات زرع هي وسيلة فعالة للتحقيق في خصائص تجديد السكان الخلية، فمن المعروف أن مثل هذه المقايسات قد تحفز اللدونة كما تؤخذ الخلايا بعيدا عن موائلها الأصلية، والتغيرات التي قد تحدث عندما يتم فصل الخلايا من محيطهم الفسيولوجية 7 . لذلك، والحصول مباشرة في دليل الجسم الحي من مصير الخلية هو النهج الرئيسي لتعزيز الفهم الحالي لسلوك السكان البطانية.
رسم الخرائط الوراثية مصير ( أي في الجسم الحي تتبع النسب) أمر حتمي لتحديد فيسكس والتحقيق في خصائصها في نظام الجسم، كما يمكن أن تكشف في الجسم الحي سلوك الخلايا الجذعية في سياقها الفسيولوجي، ويمكن أن تكون الجذعية الفعلية تقييم. النسب تراسينانوغرام يوفر دليلا مباشرا على استمرار على المدى الطويل ( أي التجديد الذاتي) من المرشحات فيسكس وقدرتها على إنتاج أنواع الخلايا للأنسجة المنشأ ( أي قوة التمايز).
يصف هذا البروتوكول الرواية الثديية تقنية زرع لوحة الدهون وطريقة تتبع النسب لمراقبة قدرة توليد السفن من فيسكس. هذه التقنيات التغلب على أوجه القصور من المقايسات المتاحة حاليا وتوفير طريقة جديدة لتقييم أمثل خصائص الخلايا الجذعية فيسكس. هذه النهج هي أدوات فعالة التي يمكن استخدامها لتقييم السلوك والخصائص تشكيل السفن من السكان البطانية، وكذلك لتحديد الأوعية الدموية تعديل قوة عزم في بيئة مرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
مقايسات الأوعية الدموية تمثل نهجا تجريبيا جيدا لدراسة ديناميات الأوعية الدموية. الماوس الأوعية الدموية في شبكية العين، الذي يتطور بعد الولادة، وقد ثبت أن يكون نموذجا جذابا لدراسة الأوعية الدموية 12 . على الرغم من أنه يمكن الوصول إليها نسبيا، والتلاعب ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31530045 و 31371500 ل ياز، 31401245 إلى كسي)، وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2014CB964800)، والأكاديمية الصينية للعلوم (XDB19000000 إلى ياز)، والصينيين جمعية البيولوجيا الخلوية (الزمالة في وقت مبكر الوظيفي ل كسي).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
