Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires
Summary
Ce travail démontre une approche novatrice pour évaluer la prolifération, la différenciation et le potentiel de formation des vaisseaux des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) par une transplantation de graisse mammaire, suivie d'une préparation tissulaire complète pour l'observation microscopique. Une stratégie de traçage de lignage pour étudier le comportement des VESC in vivo est également présentée.
Abstract
Les cellules endothéliales (CE) sont les éléments fondamentaux de l'architecture vasculaire et mesurent la croissance vasculaire et le remodelage pour assurer un développement adéquat des vaisseaux et une homéostasie. Cependant, les études sur la hiérarchie des lignées endothéliales restent difficiles à respecter en raison de l'absence d'outils pour accéder à leurs connaissances et d'évaluer directement leur comportement in vivo . Pour remédier à cette lacune, un nouveau modèle de tissu pour étudier l'angiogenèse à l'aide du tampon gras mammaire a été développé. La glande mammaire se développe principalement dans les étapes postnatales, y compris la puberté et la grossesse, au cours desquelles une prolifération robuste de l'épithélium s'accompagne d'un remodelage vasculaire étendu. Les tampons à graisse mammaire fournissent des stimuli spatiaux, matriciels et riches en angiogénie de l'épithélium mammaire en croissance. En outre, les tampons à graisse mammaire sont situés à l'extérieur de la cavité péritonéale, ce qui en fait un site de greffage facilement accessible pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. Ce travail décrit également une efficacitéNt approche de traçage en utilisant des souris rapporteurs fluorescentes pour étiqueter spécifiquement la population ciblée de cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) in vivo . Cette méthode de traçage de lignage, associée à un microscopie de tissu entier, permet la visualisation directe des cellules ciblées et de leurs descendants, grâce auxquelles la capacité de prolifération peut être quantifiée et l'engagement de différenciation peut être cartographié. En utilisant ces méthodes, une population de récepteurs de protéine Bipotent (Procr) exprimant des VESC a récemment été identifiée dans de multiples systèmes vasculaires. Procr + VESC, donnant naissance à la fois de nouvelles EC et des pericytes, contribuent activement à l'angiogenèse au cours du développement, de l'homéostasie et de la réparation des blessures. Dans l'ensemble, ce manuscrit décrit une nouvelle transplantation de graisse mammaire et des techniques de traçage de lignage in vivo qui peuvent être utilisées pour évaluer les propriétés des cellules souches des VESC.
Introduction
Au cours du développement et de l'homéostasie, la croissance vasculaire et le remodelage se déroulent fidèlement en fonction de la croissance et de la réparation des organes. L'angiogenèse décrit la génération de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux sanguins préexistants et est considérée comme une force majeure en médiation de ces changements vasculaires dynamiques. Chaque vaisseau sanguin est doublé à l'intérieur d'une couche de cellules endothéliales (EC), et ils semblent être le fondement de l'architecture des navires. Pendant longtemps, le mécanisme par lequel le pool de la CE est reconstitué pendant l'homéostasie est resté incertain et des arguments ont été soulevés sur le fait que le renouvellement vasculaire est le résultat d'une prolifération mature de la CE ou est la contribution des activités vasculaires des cellules souches / progénitrices. En raison de l'absence de données physiologiques directes, l'existence et l'identité cellulaire des cellules souches endothéliales vasculaires (VESC) sont également restés controversés.
L'une des approches les plus communes utilisées pour vérifier le comportement des cellules souches est à travers le transplanTation de cellules souches putatives dans des souris destinataires. Cette méthode mesure le potentiel de la tige des cellules souches candidates in vivo. La transplantation a d'abord été appliquée à l'étude des cellules souches de la moelle osseuse 1 , ce qui a contribué à l'établissement des caractéristiques hiérarchiques du système hématopoïétique 2 . Dans le champ endothélial, un bouchon de matrice de membrane basique ( p. Ex ., Matrigel) inséré sous la peau sous le flanc a été un test standard d' angiogenèse in vivo utilisé pour traiter les capacités de formation des vaisseaux des CE transplantés. Plusieurs méthodes expérimentales, y compris la formation de colonies dans les systèmes de culture 3D et la transplantation, ont suggéré des populations potentielles de progéniteurs / VESC de la CE 3 , 4 , 5 , 6 . Cependant, comme les EC incorporés dans la matrice de la membrane du sous-sol sont relativement séparés deLe tissu environnant, cela ne fournit pas l'environnement de niche optimal requis pour explorer pleinement le potentiel angiogénique des cellules transplantées. En conséquence, les vaisseaux formés à l'intérieur du bouchon de matrice sont principalement de type capillaire et sont fonctionnellement non mesurables.
La glande mammaire se développe par voie postnatale, la croissance la plus forte se produisant pendant la puberté et la grossesse. Au stade pubertaire, l'épithélium mammaire subit une expansion rapide, pour occuper l'ensemble des graisses mammaires, accompagné d'un remodelage efficace des structures vasculaires environnantes. Ainsi, la glande mammaire offre un excellent modèle pour l'étude de l'angiogenèse. Il fournit de l'espace, de la matrice et des stimuli angiogéniques riches à partir de l'épithélium mammaire grandissant et constitue donc un site de greffage idéal pour évaluer le potentiel angiogénique des cellules exogènes. En outre, le tampon gras mammaire permet aux vaisseaux exogènes formés de s'intégrer au système de circulation de l'hôte, ce qui permet d'ajouter fÉvaluation décentralisée et représentant un avantage sur la transplantation sous-cutanée.
Bien que les essais de culture et de transplantation in vitro soient un moyen efficace d'étudier les propriétés de régénération d'une population cellulaire, on sait que de tels tests peuvent stimuler la plasticité lorsque les cellules sont retirées de leurs habitats indigènes et que des changements peuvent être induits lorsque les cellules sont déconnectées de Leur environnement physiologique 7 . Par conséquent, l'obtention de preuves directes in vivo du devenir cellulaire est l'approche clé pour faire avancer la compréhension actuelle du comportement des populations endothéliales.
La cartographie du devenir génétique ( c.-à-d., Le traçage des lignées in vivo ) est impératif pour l'identification des VESC et pour l'étude de leurs propriétés dans le système du corps, car il peut révéler le comportement des cellules souches in vivo dans son contexte physiologique et la tige réelle peut être Évalué. Traits de lignageNg fournit une preuve directe de la persistance à long terme ( c. -à- d. L' auto-renouvellement) des VESC candidats et leur capacité à produire des types de cellules pour le tissu d'origine ( c'est-à-dire la puissance de différenciation).
Ce protocole décrit une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire et une méthode de traçage de lignée pour observer la capacité de génération de vaisseau des VESC. Ces techniques suppriment les faiblesses des tests actuellement disponibles et fournissent une nouvelle façon d'évaluer de manière optimale les propriétés des cellules souches des VESC. Ces approches sont des outils efficaces qui peuvent être utilisés pour évaluer le comportement et les propriétés de formation des vaisseaux des populations endothéliales, ainsi que pour déterminer l'altération de la puissance des cellules vasculaires dans un environnement pathologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les analyses d'angiogenèse représentent une bonne approche expérimentale pour étudier la dynamique vasculaire. La vascularisation de la rétine de la souris, qui se développe par voie postnatale, s'est avérée être un modèle attrayant pour étudier l'angiogenèse 12 . Bien qu'il soit relativement accessible, la manipulation réelle dans le lit vasculaire de la rétine est plutôt difficile. Jusqu'à présent, la transplantation in vivo la mieux décrite a ét?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31530045 et 31371500 à YAZ, 31401245 à QCY), le Ministère de la Science et de la Technologie de Chine (2014CB964800), l'Académie chinoise des sciences (XDB19000000 à YAZ) et les Chinois Société de biologie cellulaire (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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