Eine neuartige Mamma-Fat-Pad-Transplantationstechnik zur Visualisierung der Gefäßerzeugung von vaskulären endothelialen Stammzellen
Summary
Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Bewertung der Proliferations-, Differenzierungs- und Gefäßbildungspotenziale vaskulärer endothelialer Stammzellen (VESCs) durch Mamma-Fett-Pad-Transplantation, gefolgt von einer ganzheitlichen Gewebepräparation für die mikroskopische Beobachtung. Eine Abstammungsstrategie zur Untersuchung des Verhaltens von VESCs in vivo wird ebenfalls vorgestellt.
Abstract
Endothelzellen (ECs) sind die grundlegenden Bausteine der Gefäßarchitektur und vermitteln das vaskuläre Wachstum und die Umgestaltung, um eine ordnungsgemäße Gefäßentwicklung und Homöostase zu gewährleisten. Allerdings bleiben Studien über die endotheliale Linienhierarchie aufgrund des Mangels an Instrumenten, um Zugang zu erhalten, sowie um ihr Verhalten in vivo direkt zu bewerten. Um dieses Manko anzusprechen, wurde ein neues Gewebemodell entwickelt, um die Angiogenese mit dem Brustfettkissen zu untersuchen. Die Milchdrüse entwickelt sich vor allem in den postnatalen Stadien, einschließlich der Pubertät und der Schwangerschaft, bei denen eine robuste Epithelproliferation von einer umfangreichen vaskulären Remodellierung begleitet wird. Mamma-Fett-Pads bieten Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mamma-Epithel. Darüber hinaus befinden sich Mamma-Fett-Pads außerhalb der Peritonealhöhle, so dass sie eine leicht zugängliche Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen sind. Diese Arbeit beschreibt auch eine EffizienzNt-Tracing-Ansatz mit fluoreszierenden Reporter-Mäusen, um die Zielpopulation von vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) in vivo spezifisch zu markieren. Diese Linienverfolgungsmethode, gepaart mit der nachfolgenden Gewebe-Vollmontage-Mikroskopie, ermöglicht die direkte Visualisierung von zielgerichteten Zellen und deren Nachkommen, durch die die Proliferationsfähigkeit quantifiziert werden kann und die Differenzierungsverpflichtung schicksaliert werden kann. Unter Verwendung dieser Verfahren wurde eine Population von Bipotenten-Protein-C-Rezeptor (Procr), die VESCs exprimieren, kürzlich in multiplen Gefßsystemen identifiziert worden. Procr + VESCs, die sowohl neue ECs als auch Perizyten verursachen, tragen aktiv zur Angiogenese bei der Entwicklung, Homöostase und Verletzungsreparatur bei. Insgesamt beschreibt dieses Manuskript eine neue Mamma-Fett-Pad-Transplantation und In-vivo- Lineage-Tracing-Techniken, die verwendet werden können, um die Stammzellen-Eigenschaften von VESCs zu bewerten.
Introduction
Während der Entwicklung und Homöostase findet das Gefäßwachstum und die Umgestaltung nach Organwachstum und -reparatur statt. Die Angiogenese beschreibt die Erzeugung neuer Gefäße aus bereits vorhandenen Blutgefäßen und wird als eine wichtige Kraft angesehen, die diese dynamischen vaskulären Veränderungen vermittelt. Jedes Blutgefäß ist mit einer Schicht von Endothelzellen (ECs) innerlich ausgekleidet, und sie scheinen die Grundlage der Gefäßarchitektur zu sein. Der Mechanismus, durch den der EC-Pool während der Homöostase aufgefüllt wird, blieb lange Zeit unklar, und es wurden Argumente erhoben, ob der Gefäßumsatz das Ergebnis einer reifen EG-Proliferation ist oder der Beitrag der vaskulären Stamm- / Vorläuferzellaktivitäten ist. Aufgrund des Mangels an direkten physiologischen Beweisen blieb die Existenz und die zelluläre Identität der vaskulären endothelialen Stammzellen (VESCs) ebenfalls umstritten.
Eine der häufigsten Ansätze zur Verifizierung des Stammzellverhaltens ist durch den TransplanTaten von putativen Stammzellen in Empfängermäusen. Diese Methode misst das Stemnesspotential der Kandidatenstammzellen in vivo. Die Transplantation wurde zuerst auf die Untersuchung von Knochenmarkstammzellen 1 angewendet, die zur Etablierung der hierarchischen Eigenschaften des hämatopoetischen Systems 2 beigetragen haben. Im endothelialen Feld wurde ein unterhalb der Flankenhaut subkutan eingelegter Basalmembranmatrix ( z. B. Matrigel) -Stift ein Standard- In-vivo- Angiogenese-Assay, der verwendet wurde, um die Gefäßbildungsfähigkeiten von transplantierten ECs zu adressieren. Mehrere experimentelle Methoden, einschließlich Koloniebildung in 3D-Kultursystemen und Transplantation, haben potenzielle EC-Progenitor- / VESC-Populationen 3 , 4 , 5 , 6 vorgeschlagen . Da jedoch ECs, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind, relativ getrennt sindDas umliegende Gewebe, bietet dies nicht die optimale Nischenumgebung, die erforderlich ist, um das angiogenetische Potential von transplantierten Zellen vollständig zu erforschen. Infolgedessen sind die im Matrixstecker gebildeten Gefäße überwiegend kapillarartig und funktionell unermesslich.
Die Brustdrüse entwickelt sich postnatal, wobei das robusteste Wachstum während der Pubertät und Schwangerschaft auftritt. Im Pubertalstadium erleidet das Mammaepithel eine rasche Expansion, um das ganze Brustfettkissen zu besetzen, begleitet von der effizienten Umgestaltung der umgebenden Gefäßstrukturen. So bietet die Brustdrüse ein hervorragendes Modell für die Untersuchung der Angiogenese. Es bietet Raum, Matrix und reiche angiogene Reize aus dem wachsenden Mammaepithel und ist daher eine ideale Pfropfstelle für die Beurteilung des angiogenen Potentials exogener Zellen. Darüber hinaus ermöglicht das Brustfett-Pad die geformten exogenen Gefäße mit dem Wirtszirkulationssystem zu integrieren, so dass weitere fUnreduzierte Bewertung und einen Vorteil gegenüber der subkutanen Transplantation darstellen.
Obwohl in vitro Kultivierungs- und Transplantationsassays als wirksame Methode zur Untersuchung der Regenerationseigenschaften einer Zellpopulation sind, ist es bekannt, dass solche Assays die Plastizität stimulieren können, wenn die Zellen von ihren nativen Lebensräumen entfernt werden, und Veränderungen können induziert werden, wenn Zellen von der Verbindung getrennt werden Ihre physiologische Umgebung 7 . Daher ist die Erlangung eines direkten In-vivo- Nachweises des Zellschicksals der Schlüsselansatz, um das gegenwärtige Verständnis des Verhaltens der endothelialen Populationen voranzutreiben.
Die genetische Schicksalskartierung ( dh in vivo- Linienverfolgung) ist für die Identifizierung von VESCs und für die Untersuchung ihrer Eigenschaften im Körpersystem zwingend erforderlich, da sie in ihrem physiologischen Kontext in vivo Stammzellenverhalten offenbaren kann und die eigentliche Stämme sein können Beurteilt Lineage traciNg liefert einen direkten Beweis für die langfristige Persistenz ( dh die Selbsterneuerung) der Kandidaten-VESCs und ihre Fähigkeit, Zelltypen für das Ursprungsgewebe ( dh Differenzierungspotenz) zu erzeugen.
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Mamma-Fett-Pad-Transplantationstechnik und eine Lineage-Tracing-Methode, um die Gefäßerzeugungsfähigkeit von VESCs zu beobachten. Diese Techniken überwinden Mängel der derzeit verfügbaren Assays und bieten einen neuen Weg, um die Stammzelleneigenschaften von VESCs optimal zu bewerten. Diese Ansätze sind effiziente Werkzeuge, die verwendet werden können, um das Verhalten und die Gefäßformung von endothelialen Populationen zu beurteilen sowie die vaskuläre Zellpotenzveränderung innerhalb einer pathologischen Umgebung zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenese-Assays stellen einen guten experimentellen Ansatz dar, um die Gefäßdynamik zu untersuchen. Maus retinalen Gefäß, die postnatal entwickelt, hat sich als ein attraktives Modell sein Angiogenese 12 zu studieren. Obwohl es relativ zugänglich ist, ist die tatsächliche Manipulation innerhalb des Retina-Gefäßbettes ziemlich schwierig. Bisher war die am besten beschriebene in vivo- Transplantation der Plug-Assay, der Zellen in einer Basalmembran-Matrixmasse umgibt und chirurg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (31530045 und 31371500 bis YAZ, 31401245 bis QCY), dem Ministerium für Wissenschaft und Technologie von China (2014CB964800), der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (XDB19000000 bis YAZ) und den Chinesen unterstützt Gesellschaft der Zellbiologie (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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