En ny mammografisk feta padtransplantationsteknik för att visualisera fartygsgenerering av vaskulära endotelceller
Summary
Detta arbete demonstrerar ett nytt tillvägagångssätt för att bedöma den proliferation, differentiering och kärlbildande potentialen hos vaskulära endotelceller (VESC) genom bröstkorgtransplantation med bröstkorg följt av helmonterad vävnadstillverkning för mikroskopisk observation. En linjespårningsstrategi för att undersöka VESCs beteende in vivo presenteras också.
Abstract
Endotelceller (ECs) är de grundläggande byggstenarna i vaskulärarkitekturen och medlar vaskulär tillväxt och ombyggnad för att säkerställa korrekt kärlutveckling och homeostas. Studier om endotelceller härarki förblir dock blygsamma på grund av bristen på verktyg för att få tillgång såväl som att direkt utvärdera deras beteende in vivo . För att ta itu med denna brist har en ny vävnadsmodell för att studera angiogenes med hjälp av bröstfettpulsen utvecklats. Bröstkörteln utvecklas mestadels i postnatala stadier, inklusive puberteten och graviditeten, under vilken robust epithelsproliferation åtföljs av omfattande vaskulär remodeling. Mammarfettkuddar ger utrymme, matris och rika angiogena stimuli från det växande bröstpiteliet. Vidare är bröstfettkuddar placerade utanför bukhålan, vilket gör dem till en lättillgänglig ympningsplats för att utvärdera den exogena angiogena potentialen. Detta arbete beskriver också en effektivitetNt-spårningsmetoden med användning av fluorescerande reportermöss för att specifikt märka den riktade populationen av vaskulära endotelceller (VESCs) in vivo . Denna linjespårningsmetod, i kombination med efterföljande vävnads helmonterad mikroskopi, möjliggör direkt visualisering av riktade celler och deras efterkommande, genom vilka proliferationsförmågan kan kvantifieras och differentieringsåtagandet kan vara öde-mappat. Med användning av dessa metoder har en population av bipotent protein C-receptor (Procr) som uttrycker VESCs nyligen identifierats i flera vaskulära system. Procr + VESC, som ger upphov till både nya EC och pericytes, bidrar aktivt till angiogenes under utveckling, homeostas och reparation av skador. Sammanfattningsvis beskriver detta manuskript en ny bröstkorgtransplantation av bröstkorg och in vivo linjespårningstekniker som kan användas för att utvärdera stamcellsegenskaperna hos VESC.
Introduction
Under utveckling och homeostasis sker kärltillväxt och ombyggnad trogen i enlighet med organtillväxt och reparation. Angiogenes beskriver genereringen av nya kärl från befintliga blodkärl och anses vara en viktig kraft som medierar dessa dynamiska vaskulära förändringar. Varje blodkärl är innerfodrad med ett lager av endotelceller (ECs), och de verkar vara grunden för fartygsarkitekturen. Under lång tid kvarstår mekanismen genom vilken EC-poolen fylls under homeostas, och argument höjdes över huruvida vaskulär omsättning är resultatet av mogen EC-proliferation eller är bidraget från vaskulär stam / progenitorcellaktivitet. På grund av bristen på direkta fysiologiska bevis förblev förekomsten och cellidentiteten hos vaskulära endotelceller (VESCs) kontroversiella.
En av de vanligaste metoderna för att verifiera stamcellsbeteendet är genom transplanenTation av förmodade stamceller i mottagande möss. Denna metod mäter stamcellerpotentialen hos kandidatstamceller in vivo. Transplantationen applicerades först på studien av benmärgsstamceller 1 , vilket bidrog till upprättandet av de hierarkiska egenskaperna hos det hematopoietiska systemet 2 . I endotelfältet har en basmembranmatrismatris ( t.ex. matrigel) -plugg infogad subkutant under flankhuden varit en standard in vivo- angiogenesassay använd för att adressera kärlbildningsförmågan hos transplanterade ECs. Flera försöksmetoder, inklusive kolonnbildning i 3D-kultursystem och transplantation, har föreslagit potentiella EC-progenitor / VESC-populationer 3 , 4 , 5 , 6 . Emedan emellertid ECs inbäddade i basalmembranmatrisen är relativt separata frånDen omgivande vävnaden, ger detta inte den optimala nischmiljön som krävs för att fullständigt utforska den angiogena potentialen hos transplanterade celler. Som ett resultat är kärl som bildas inuti matrispluggen övervägande kapillärliknande och funktionellt obestridliga.
Bröstkörteln utvecklas postnatalt, med den mest robusta tillväxten som uppstår under puberteten och graviditeten. Vid pubertalstiden genomgår bröstepitelet en snabb expansion, för att uppta hela magsfettkudden, åtföljd av effektiv ombyggnad av de omgivande kärlstrukturerna. Bröstkörteln erbjuder således en utmärkt modell för studier av angiogenes. Det ger utrymme, matris och rika angiogena stimuli från det växande bröstepitelet och är därför en ideal ympningsplats för att bedöma den exogena angiogena potentialen. Dessutom tillåter bröstfettkudden att de bildade exogena kärlen integreras med värdcirkulationssystemet, vilket möjliggör vidare fOunktuell utvärdering och representerar en fördel jämfört med subkutan transplantation.
Även om in vitro- odlings- och transplantationsanalyser är lika effektiva sätt att undersöka regenereringsegenskaperna hos en cellpopulation är det känt att sådana analyser kan stimulera plasticitet när celler tas bort från deras naturliga livsmiljöer och förändringar kan induceras när celler kopplas från Deras fysiologiska omgivningar 7 . Därför är det viktigt att få fram direkta in vivo- bevis för cellförlust för att främja den nuvarande förståelsen för beteendet hos endotela populationer.
Genetisk ödet kartläggning ( dvs. in vivo lineage-spårning) är absolut nödvändigt för identifiering av VESC och för undersökning av deras egenskaper i kroppssystemet, eftersom det kan avslöja in vivo stamcellsbeteende i dess fysiologiska sammanhang och den faktiska stammen kan vara bedömas. Lineage traciNg ger direkt bevis på den långsiktiga persistensen ( dvs. självförnyelse) av kandidat VESCs och deras förmåga att producera celltyper för ursprungsvävnaden ( dvs. differentieringspotential).
Detta protokoll beskriver en ny mammografisk fettpudstransplantationsteknik och en linjespårningsmetod för att observera VESC: s generering av kärlproduktion. Dessa tekniker övervinner brister i nuvarande tillgängliga analyser och tillhandahåller ett nytt sätt att optimalt utvärdera stamcellsegenskaperna hos VESCs. Dessa tillvägagångssätt är effektiva verktyg som kan användas för att bedöma beteende och kärlbildande egenskaper hos endotelpopulationer, samt att bestämma förändring av vaskulärcellens potens i en patologisk miljö.
Protocol
Representative Results
Discussion
Angiogenesanalyser representerar ett bra experimentellt tillvägagångssätt för att studera vaskulär dynamik. Mus retinal vaskulatur, som utvecklas postnatalt, har visat sig vara en attraktiv modell för att studera angiogenes 12 . Trots att det är relativt lättillgängligt är den verkliga manipuleringen inom kärlns kärlbädd ganska svår. Hittills har den mest beskrivna in vivo- transplantationen varit plug-analysen, vilken omsluter celler inuti en basmembranmatrismassa och kiru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31530045 och 31371500 till YAZ, 31401245 till QCY), Kinesiska ministeriet för vetenskap och teknik (2014CB964800), The Chinese Academy of Sciences (XDB19000000 till YAZ) och den kinesiska Samhället för cellbiologi (Early Career Fellowship till QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
- Thomas, E. D., Lochte, H. L., Lu, W. C., Ferrebee, J. W. Intravenous infusion of bone marrow in patients receiving radiation and chemotherapy. N Engl J Med. 257 (11), 491-496 (1957).
- Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
- Bompais, H., et al. Human endothelial cells derived from circulating progenitors display specific functional properties compared with mature vessel wall endothelial cells. Blood. 103 (7), 2577-2584 (2004).
- Fang, S., Wei, J., Pentinmikko, N., Leinonen, H., Salven, P. Generation of functional blood vessels from a single c-kit+ adult vascular endothelial stem cell. PLoS Biol. 10 (10), e1001407 (2012).
- Naito, H., Kidoya, H., Sakimoto, S., Wakabayashi, T., Takakura, N. Identification and characterization of a resident vascular stem/progenitor cell population in preexisting blood vessels. EMBO J. 31 (4), 842-855 (2012).
- Yoder, M. C., et al. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109 (5), 1801-1809 (2007).
- Snippert, H. J., Clevers, H. Tracking adult stem cells. Embo Rep. 12 (2), 113-122 (2011).
- Yu, Q. C., Song, W., Wang, D., Zeng, Y. A. Identification of blood vascular endothelial stem cells by the expression of protein C receptor. Cell Res. 26 (10), 1079-1098 (2016).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Wang, D. S., et al. Identification of multipotent mammary stemcells by protein C receptor expression. Nature. 517, 81-U201 (2015).
- Stahl, A., et al. The Mouse Retina as an Angiogenesis Model. Invest Ophth Vis Sci. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012 (2014).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143 (1), 134-144 (2010).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nat Genet. 21 (1), 70-71 (1999).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17 (6), 849-860 (2009).
