Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares
Summary
Este trabalho demonstra uma nova abordagem para avaliar a proliferação, diferenciação e potencial de formação de vasos de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) através do transplante de almofada de gordura mamária, seguido de preparação de tecido total para a observação microscópica. Também é apresentada uma estratégia de rastreamento de linhagem para investigar o comportamento de VESC in vivo .
Abstract
As células endoteliais (ECs) são os blocos fundamentais da arquitetura vascular e medem o crescimento vascular e a remodelação para assegurar o desenvolvimento adequado dos vasos e a homeostase. No entanto, os estudos sobre a hierarquia da linhagem endotelial permanecem evasivos devido à falta de ferramentas para obter acesso, bem como para avaliar diretamente seu comportamento in vivo . Para resolver esta deficiência, um novo modelo de tecido para estudar angiogênese usando a almofada de gordura mamária foi desenvolvido. A glândula mamária desenvolve-se principalmente nos estádios pós-natais, incluindo a puberdade e a gravidez, durante os quais a proliferação robusta do epitélio é acompanhada de uma vasta remodelação vascular. As almofadas de gordura mamárias fornecem estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos do epitélio mamário em crescimento. Além disso, as almofadas de gordura mamária estão localizadas fora da cavidade peritoneal, tornando-os um local de enxerto facilmente acessível para avaliar o potencial angiogênico de células exógenas. Este trabalho também descreve uma eficiênciaAbordagem de rastreamento nt usando ratos repórter fluorescentes para rotular especificamente a população alvo de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) in vivo . Este método de rastreamento de linhagem, acoplado com o microscópio subseqüente de todo o tecido, permite a visualização direta de células direcionadas e seus descendentes, através das quais a capacidade de proliferação pode ser quantificada e o compromisso de diferenciação pode ser mapeado pelo destino. Usando esses métodos, uma população de receptores de proteína Bipotente (Procr) expressando VESCs recentemente foi identificada em sistemas vasculares múltiplos. Procr + VESCs, dando origem a novas ECs e pericítas, contribuem ativamente para a angiogênese durante o desenvolvimento, homeostase e reparação de lesões. No geral, este manuscrito descreve um novo transplante de almofadas de gordura mamária e técnicas de rastreamento de linhagem in vivo que podem ser usadas para avaliar as propriedades das células-tronco dos VESCs.
Introduction
Durante o desenvolvimento e a homeostase, o crescimento vascular e a remodelação ocorrem fielmente de acordo com o crescimento e reparo de órgãos. A angiogênese descreve a geração de novos vasos a partir de vasos sanguíneos pré-existentes e é considerada uma força importante que medeia essas mudanças vasculares dinâmicas. Cada vaso sanguíneo é revestido internamente com uma camada de células endoteliais (ECs), e eles parecem ser o fundamento da arquitetura do vaso. Durante muito tempo, o mecanismo através do qual o pool da CE é reabastecido durante a homeostase permaneceu obscuro, e os argumentos foram levantados sobre se o turnover vascular é o resultado da proliferação madura da CE ou é o contributo das atividades vasculares das células-tronco / progenitoras. Devido à falta de evidências fisiológicas diretas, a existência e a identidade celular das células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) também permaneceram controversas.
Uma das abordagens mais comuns utilizadas para verificar o comportamento das células-tronco é através do transplanProdução de células estaminais putativas em camundongos receptores. Este método mede o potencial de haste de células-tronco candidatas in vivo. O transplante foi aplicado pela primeira vez ao estudo de células-tronco da medula óssea 1 , o que contribuiu para o estabelecimento das características hierárquicas do sistema hematopoiético 2 . No campo endotelial, um tampão da matriz da membrana basal ( por exemplo, matrigel) inserido subcutaneamente sob a pele do flanco foi um ensaio padrão de angiogênese in vivo usado para abordar as capacidades de formação de vasos das CE transplantadas. Múltiplos métodos experimentais, incluindo a formação de colônias em sistemas de cultura 3D e transplante, sugeriram potenciais populações de progenitores EC / VESC 3 , 4 , 5 , 6 . No entanto, uma vez que as EC incorporadas na matriz da membrana basal são relativamente separadas deO tecido circundante, isso não fornece o melhor ambiente de nicho necessário para explorar completamente o potencial angiogênico das células transplantadas. Como resultado, os vasos formados dentro do plugue da matriz são predominantemente capilares e são funcionalmente incomensuráveis.
A glândula mamária se desenvolve pós-natal, com o crescimento mais robusto ocorrido durante a puberdade e a gravidez. No estágio puberal, o epitélio mamário sofre uma expansão rápida, para ocupar toda a almofada de gordura mamária, acompanhada pela remodelação eficiente das estruturas vasculares circundantes. Assim, a glândula mamária oferece um excelente modelo para o estudo da angiogênese. Fornece estímulos angiogênicos espaciais, matriciais e ricos do epitélio mamário em crescimento e, portanto, é um local de enxerto ideal para avaliar o potencial angiogênico de células exógenas. Além disso, a almofada de gordura mamária permite que os vasos exógenos formados se integrem com o sistema de circulação do hospedeiro, permitindo mais fAvaliação uncional e representando uma vantagem sobre o transplante subcutâneo.
Embora os ensaios de cultura e transplante in vitro sejam um modo tão eficaz de investigar as propriedades de regeneração de uma população de células, é sabido que tais ensaios podem estimular a plasticidade à medida que as células são retiradas dos seus habitats nativos e as mudanças podem ser induzidas quando as células são desconectadas de Seu ambiente fisiológico 7 . Portanto, a obtenção de evidência direta in vivo de destino celular é a abordagem chave para avançar a compreensão atual do comportamento das populações endoteliais.
O mapeamento do destino genético ( ou seja, o rastreamento de linhagem in vivo ) é imperativo para a identificação de VESCs e para a investigação de suas propriedades no sistema corporal, pois pode revelar o comportamento de células estaminais in vivo em seu contexto fisiológico e a estabilidade real pode ser Avaliado. Traçados de linhagemNg fornece evidências diretas da persistência a longo prazo ( isto é, auto-renovação) dos VESC candidatos e sua capacidade de produzir tipos de células para o tecido de origem ( ou seja, potência de diferenciação).
Este protocolo descreve uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária e um método de rastreamento de linhagem para observar a capacidade de geração de vasos de VESCs. Essas técnicas superam as deficiências dos ensaios atualmente disponíveis e fornecem uma nova maneira de avaliar otimamente as propriedades das células-tronco dos VESCs. Essas abordagens são ferramentas eficientes que podem ser usadas para avaliar o comportamento e as propriedades de formação de vasos das populações endoteliais, bem como para determinar a alteração da potência celular vascular dentro de um ambiente patológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os ensaios de angiogênese representam uma boa abordagem experimental para estudar a dinâmica vascular. A vasculatura da retina do mouse, que se desenvolve pós-natal, provou ser um modelo atraente para estudar angiogênese 12 . Apesar de ser relativamente acessível, a manipulação real dentro do retículo vascular é bastante difícil. Até agora, o transplante in vivo melhor descrito foi o ensaio de plugue, que encerra células dentro de uma massa de matriz de membrana basal e impla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (31530045 e 31371500 a YAZ, 31401245 a QCY), o Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2014CB964800), a Academia Chinesa de Ciências (XDB19000000 a YAZ) e os chineses Sociedade de Biologia Celular (Early Career Fellowship to QCY).
Materials
| 0.05% Trypsin-Ethylene Diamine Tetraacetic Acid(EDTA) (1X) | Gibco (Life Technologies) | 25300-062 | 0.05% Trypsin |
| 0.22 µm Filter Unit | Merck Millipore Ltd. | SLGP033RB | 0.22 µm Filter |
| 2-Methylbutanol-2, ReagentPlus | Sigma-Aldrich | 24, 048-6 | Tert Amyl Alcohol |
| 222, Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25g | 222, Tribromethanol |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) | Invitrogen | D1306 | DAPI |
| 70 µm Cell Strainer | BD FAL | 352350 | 70 µm Cell Strainer |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 188105 | Glass slides |
| Anti-mouse CD105 APC | eBioscience | 17-1051-82, clone MJ7/18 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| Anti-mouse CD201 Biotin | eBioscience | 13-2012-82 | for FACS analusis use at 2.5 µg/mL |
| Anti-mouse CD31 PE-Cyanine 7 | eBioscience | 25-0311-82, clone 390 | for FACS analusis use at 1 µg/mL |
| BD FACSJazz Cell Sorter | BD Biosciences | 655489 | FACS |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 100190332 | BSA |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge |
| Collagenase type 3 | Worthington-Biochem | #LS004183 | Collagenase III |
| Confocal microscopy | Leica | sp8 | Confocal |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D2463-5VL | Dnase I |
| Donkey anti-Rat Cy3 | Jackson ImmunResearch | 712-165-150 | Secondary antibody, use at 0.5 µg/mL |
| Dumont Forceps | WPI | 500342 | Froceps |
| Dumont Forceps – Micro-Blunted Tips | FST | 11253-20 | Forceps |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | FBS |
| FITC Ms CD3/Gr1/CD11b/CD45R(B220)/Ter-119 | BioLegend | 78022 | Blood lineage cocktail for FACS analysis, use at 25 µl per test |
| Glycerol | Sigma | G6279 | Glycerol |
| Iscov's Modified Dulbecco's Medium | Gibco (Life Technologies) | 12440-053 | IMDM |
| Isolectin GS-IB4 from Griffonia Simplicifolia, Alexa Fluora 647 | Invitrogen | Z32450 | Isolectin-647 |
| Matrigel Matrix (growth factor reduced) | BD | 356231 | Matrigel |
| Mouse strain (Actin-GFP) | Jax Laboratories | 3773 | Actin-GFP |
| Mouse strain (C57BL/6) | SLAC | C57BL/6 | C57BL/6 |
| Mouse strain (BALB/c nude) | SLAC | BALB/c nude | Nude mice |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | PFA |
| Penicilin Streptomycin | Gibco (Life Technologies) | 5140-122 | Pen/Strep |
| Phosphate Buffered Saline (pH7.2) 1X | Gibco (Life Technologies) | c20012500BT | PBS |
| PRIM1640 | Gibco (Life Technologies) | c11875500CP | PRIM1640 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | Mounting Medium |
| Rat anti CD144 | BD Biosciences | 550548 | for whole-mount analysis, anti-VE-Cadherin / Cdh5 antibdy for endothelial tight junction, use at 2.5 µg/mL |
| Rat anti CD31-biotin | BD Biosciences | 553371 | for whole-mount analusis, anti-CD31/PECAM1 antibody for endothelial surface adhesion molecule, use at 10 ug/mL |
| Red Cell Lysis Buffer | Sigma | R7767-100ML | Red blood cell lysing buffer |
| Straight/Sharp-Blunt/10cm | FST | 14028-10 | Fine Scissors |
| Streptavidin eFluor 450 | eBioscience | 48-4317-82 | for FACS analysis use at 0.5 µg/mL |
| Tamoxifen | Sigma | 101551374 | TAM |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | TritonX |
| Wax Coated Braided Silk (Size 5-0 USP (1 Metric), 18 inches (45 cm) BLACK on C-1 Needle) | COVIDIEN | S1173 | Suture |
| Sterile Disposable Scaplels | Swann Morton | #10 | Scalpel |
| Betadine | Yifeng Medical | 20160101 | Antiseptic solution |
References
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