Forutsi gensletting gjennom spatiotemporal kontroll av siRNA-frigivelse fra fotoresvarende polymere nanocarriers
Summary
Vi presenterer en romanmetode som bruker fotobesvarende blokk-kopolymerer for effektivere spatiotemporal kontroll av genavstenging uten detekterbare off-target-effekter. I tillegg kan forandringer i genuttrykk forutsies ved bruk av enkle siRNA-frigivelsesanalyser og enkel kinetisk modellering.
Abstract
Nye materialer og metoder er nødvendig for bedre å kontrollere bindingen vs. frigjøring av nukleinsyrer til et bredt spekter av applikasjoner som krever nøyaktig regulering av genaktivitet. Spesielt vil nye stimuli-responsive materialer med forbedret spatiotemporal kontroll over genuttrykk oppheve oversettbare plattformer i narkotikaforskning og regenerativ medisinteknologi. Videre vil en forbedret evne til å kontrollere nukleinsyrefrigivelse fra materialer muliggjøre utvikling av strømlinjeformede metoder for å forutsi nanokarrieres effektivitet a priori , noe som fører til fremskyndet screening av leveringsfordeler. Her presenterer vi en protokoll for å forutsi genlydingseffektivitet og oppnå spatiotemporal kontroll over genuttrykk gjennom et modulært fotoresvarende nanocarrier-system. Små interfererende RNA (siRNA) komplekseres med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoksy) -2-nitrobenzylmetakrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tilRm stabile nanocarriers som kan styres med lys for å lette avstembar, on / off siRNA release. Vi skisserer to komplementære analyser som benytter fluorescenskorrelasjonsspektroskopi og gelelektroforese for nøyaktig kvantifisering av siRNA-frigjøring fra løsninger som imiterer intracellulære miljøer. Informasjon som er oppnådd fra disse analysene, ble innlemmet i en enkel RNA-interferens (RNAi) kinetisk modell for å forutsi de dynamiske tyderingsresponsene på forskjellige fotostimulusforhold. I sin tur tillater disse optimaliserte bestrålingsbetingelsene forfining av en ny protokoll for spatiotemporalt kontrollerende genavstenging. Denne metoden kan generere cellulære mønstre i genuttrykk med celle til celleoppløsning og ingen påviselige off-target-effekter. Samlet sett tilbyr vår tilnærming en brukervennlig metode for å forutsi dynamiske endringer i genuttrykk og nøyaktig kontroll av siRNA-aktivitet i rom og tid. Dette sett av analyser kan lett tilpasses for å teste et bredt utvalg av otHennes stimuli-responsive systemer for å møte viktige utfordringer som er relevante for en rekke bruksområder innen biomedisinsk forskning og medisin.
Introduction
Små interfererende RNAer (siRNAer) medierer post-transkripsjonalt gen silencing gjennom en katalytisk RNAi-vei som er svært spesifikk, kraftig og skikkelig for nesten ethvert målgen 1 . Disse lovende egenskapene har gjort det mulig for siRNA-terapeutika å utvikle seg i humane kliniske studier for behandling av mange sykdommer, inkludert metastatisk melanom og hemofili 2 , 3 . Men betydelige leveringsproblemer vedvarer som har hindret oversettelse 4 . Spesielt må transportmidler forbli stabile og beskytte siRNAer mot ekstracellulær nedbrytning, men frigjør også nyttelasten i cytoplasma 5 . Videre krever mange RNAi-applikasjoner forbedrede metoder for å regulere genavstenging i rom og tid 6 , som vil redusere bivirkninger i siRNA-terapeutikk 7 og muliggjøre transformativ aDvanser i applikasjoner som spenner fra cellemikroarrays for legemiddelforskning 8 til modulering av celleresponser i regenerative stillaser 9 . Disse utfordringene markerer behovet for nye materialer og metoder for bedre å kontrollere binding mot frigjøring i siRNA nanocarriers.
En av de mest lovende strategiene for å kontrollere siRNA-frigjøring og øke spatiotemporal regulering er bruk av stimuli-responsive materialer 10 . For eksempel har et bredt utvalg av biomaterialer blitt konstruert med foranderlig nukleinsyrebindingsaffinitet som respons på endret redokspotensial eller pH, eller påførte magnetfelter, ultralyd eller lys 11 . Selv om mange av disse systemene viser forbedret kontroll over nukleinsyreaktivitet, er bruk av lys som en utløser spesielt fordelaktig på grunn av sin øyeblikkelige tidsrespons, presis romlig oppløsning og enkel avstemningsevne. <suP class = "xref"> 12. Videre er potensialet for fotokrevende teknologier for regulering av genuttrykk blitt demonstrert av toppmoderne inducerbare promotor og optogenetiske regulatorsystemer; Imidlertid lider disse systemene av utallige utfordringer, inkludert begrenset kapasitet til å regulere endogene gener, sikkerhetshensyn som immunogenicitet og vanskeligheter med å levere multikomponent-forsamlinger 13 , 14 , 15 . Foto-responsive siRNA nanocarriers er ideelle for å overvinne disse ulempene og gi en enklere og mer robust tilnærming til å spatiotemporalt modulere genuttrykk 16 , 17 , 18 . Dessverre forblir metoder for nøyaktig å forutsi den resulterende protein-knockdown-responsen unnvikende.
En viktig utfordring er at kvantitative evalueringer av siRNA-utgivelsen erSjeldne 19 , 20 , og selv når disse evalueringene utføres, har de ikke blitt koblet til analyser av siRNA / proteinomsetningsdynamikk. Både mengden siRNA utgitt og dets utholdenhet / levetid er viktige determinanter for den resulterende gentykkelsesdynamikken; Derfor er mangel på slik informasjon en stor frakobling som utelukker nøyaktig prediksjon av doserespons i RNAi 21 . Å adressere denne utfordringen vil fremskynde formuleringen av passende strukturfunksjonsforhold i nanokarrierene og bedre informere biomaterialedesigner 22 . Videre vil slike tilnærminger muliggjøre utvikling av mer effektive siRNA-doseringsprotokoller. I et forsøk på å forstå den dynamiske stillingsresponsen har flere grupper undersøkt matematiske modeller av RNAi 23 , 24 , 25 . Disse rammene varVellykket med å gi innsikt i siRNA-medierte endringer i genuttrykk og identifisere hastighetsbegrensende trinn 26 . Imidlertid har disse modellene kun blitt brukt på kommersielle genleveranser (for eksempel lipofektamin og polyetylenimin (PEI)) som ikke er i stand til kontrollert siRNA-utgivelse, og kompleksiteten til modellene har sterkt begrenset deres bruksgrad 27 . Disse manglene fremhever et ufullstendig behov for nye materialer som er i stand til nøyaktig innstillbar siRNA-utgivelse kombinert med strømlinjeformede og brukervennlige prediktive kinetiske modeller.
Vår metode retter seg mot alle disse utfordringene gjennom integrering av en lysfølsom nanocarrier-plattform med koblede metoder for å kvantifisere fri siRNA og modell RNAi-dynamikk. Spesielt blir vår plattforms nøyaktig kontrollerte siRNA-utgivelse 28 overvåket av to komplementære metoder for nøyaktig kvantifisering av innkapslet vs.Bundet siRNA. De eksperimentelle dataene fra disse analysene blir inngått i en enkel kinetisk modell for å forutsi gen-lyddempingseffektivitet a priori 29 . Til slutt utnyttes nanokarrierens on / off-natur lett for å generere cellemønstre i genuttrykk med romlig kontroll på cellelengden. Således gir denne metoden en lett tilpasningsbar metode for å kontrollere og forutsi genavstenging i en rekke applikasjoner som ville ha nytte av spatiotemporal regulering av celleadferd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er noen få skritt i metoden som er spesielt kritisk. Ved formulering av nanocarrierene er rekkefølgen av komponenttilsetning og blandingshastighet to viktige parametere som påvirker effekten 39 . Denne protokollen krever at kationisk komponent, mPEG- b -P (APNBMA), settes til den anioniske komponenten, siRNA, dråpevis mens vortexing. Avhengig av totalformuleringsvolumet tar denne blandeprosessen 3-6 s. For å teste om nanokarrierene ble dannet på riktig måte måler du størrels…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health (NIH) for økonomisk støtte gjennom en institusjonell utviklingspris (IDeA) under bevilgningsnummer P20GM103541 samt stipendnummer P20GM10344615. Uttalelsene heri gjenspeiler ikke NIHs synspunkter. Vi anerkjenner også Delaware Biotechnology Institute (DBI) og Delaware Economic Development Office (DEDO) for økonomisk støtte gjennom Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -prisen (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
