Прогнозирование гена Silencing через Spatiotemporal Контроль выхода siRNA из фоточувствительных полимерных нановолокон
Summary
Мы представляем новый метод, который использует фоточувствительные блок-сополимеры для более эффективного пространственно-временного контроля за отключением генов без каких-либо детектируемых эффектов вне мишени. Кроме того, изменения экспрессии генов могут быть предсказаны с использованием простых анализов высвобождения siRNA и простого кинетического моделирования.
Abstract
Новые материалы и методы необходимы для лучшего контроля связывания с высвобождением нуклеиновых кислот в широком спектре применений, требующих точной регуляции активности генов. В частности, новые стимулирующие стимулы материалы с улучшенным пространственно-временным контролем над экспрессией генов будут открывать переводимые платформы в технологии обнаружения лекарств и регенеративной медицины. Кроме того, повышенная способность контролировать высвобождение нуклеиновой кислоты из материалов позволила бы разработать оптимизированные методы для прогнозирования эффективности нанопорошков априори , что привело бы к ускоренному скринингу транспортных средств доставки. Здесь мы представляем протокол для прогнозирования эффективности подавления генов и достижения пространственно-временного контроля над экспрессией генов с помощью модульной фотореактивной системы наносителя. Малая интерферирующая РНК (siRNA) комплексна с полимерами mPEG- b -поли (5- (3- (амино) пропокси) -2-нитробензилметакрилата) (mPEG- b- P (APNBMA)) для foRm устойчивые нанополосы, которые можно контролировать с помощью света, чтобы облегчить перестраиваемый, включение / выключение siRNA. Мы излагаем два дополнительных анализа с использованием флуоресцентной корреляционной спектроскопии и гель-электрофореза для точной количественной оценки выделения сиРНК из растворов, имитирующих внутриклеточные среды. Информация, полученная в результате этих анализов, была включена в кинетическую модель простой РНК-интерференции (RNAi), чтобы предсказать динамические реакции глушителя на различные условия фотостимуляции. В свою очередь, эти оптимизированные условия облучения позволили уточнить новый протокол для пространственно-временного контроля молчания генов. Этот метод может генерировать клеточные структуры в экспрессии генов с разрешением клеток к клетке и без обнаруживаемых эффектов вне цели. В совокупности наш подход предлагает простой в использовании метод прогнозирования динамических изменений экспрессии генов и точное управление активности siRNA в пространстве и времени. Этот набор анализов может быть легко адаптирован для тестирования широкого спектра otЕе системы, реагирующие на стимулы, для решения ключевых проблем, связанных с множеством применений в биомедицинских исследованиях и медицине.
Introduction
Малые интерферирующие РНК (siRNAs) опосредуют замораживание после транскрипционного гена через каталитический RNAi-путь, который является высокоспецифичным, мощным и адаптируемым практически к любому гену-мишени 1 . Эти многообещающие характеристики позволили терапевтическим средствам siRNA продвигаться в клинических испытаниях человека для лечения многочисленных заболеваний, включая метастазирующую меланому и гемофилию 2 , 3 . Однако сохраняются значительные проблемы с доставкой, которые затруднили перевод 4 . В частности, средства доставки должны оставаться стабильными и защищать siRNAs от внеклеточной деградации, а также высвобождать полезную нагрузку в цитоплазму 5 . Кроме того, для многих применений RNAi требуются улучшенные методы для регулирования глушителя генов в пространстве и времени 6 , что уменьшит побочные эффекты в терапии siRNA 7 и позволит преобразовать aDvances в приложениях, начиная от клеточных микрочипов для обнаружения лекарств 8 до модуляции клеточных ответов в регенеративных лесах 9 . Эти проблемы подчеркивают необходимость в новых материалах и методах для лучшего контроля связывания с высвобождением в наноразмерах siRNA.
Одной из наиболее перспективных стратегий борьбы с высвобождением siRNA и усилением пространственно-временной регуляции является использование чувствительных к стимулам материалов 10 . Например, большое разнообразие биоматериалов было спроектировано с изменчивой аффинностью связывания нуклеиновой кислоты в ответ на измененный окислительно-восстановительный потенциал или pH, или приложенные магнитные поля, ультразвук или свет 11 . Хотя многие из этих систем демонстрируют улучшенный контроль активности нуклеиновой кислоты, использование света в качестве триггера особенно выгодно из-за его мгновенного временного отклика, точного пространственного разрешения и простоты перестраивания <suP class = "xref"> 12. Кроме того, потенциал фоточувствительных технологий для регулирования экспрессии генов был продемонстрирован с помощью современных индуцибельных промоторных и оптогенетических систем регуляторов; Однако эти системы страдают от многочисленных проблем, включая ограниченные возможности для регулирования эндогенных генов, проблемы безопасности, такие как иммуногенность, и трудности с доставкой многокомпонентных сборок 13 , 14 , 15 . Фотореактивные siRNA nanoparriers идеально подходят для преодоления этих недостатков и обеспечения более простого и более надежного подхода к пространственно-временному модулированию экспрессии генов 16 , 17 , 18 . К сожалению, методы точного предсказания результирующего ответа на нокдаун белка остаются неуловимыми.
Ключевой проблемой является то, что количественные оценки высвобождения siRNAРедко 19 , 20 , и даже когда эти оценки выполняются, они не были связаны с анализом динамики оборотов сиРНК / белка. Как количество выделяемой siRNA, так и ее персистенция / время жизни являются важными детерминантами результирующей динамики молчания генов; Следовательно, отсутствие такой информации является основным отключением, которое исключает точное прогнозирование доза-ответа в RNAi 21 . Решение этой задачи ускорит формулировку соответствующих структурно-функциональных связей в нановолокнах и улучшит информацию о конструкциях биоматериалов 22 . Кроме того, такие подходы позволят разработать более эффективные протоколы дозирования siRNA. В попытке понять реакцию динамического молчания несколько групп исследовали математические модели RNAi 23 , 24 , 25 . Эти рамки былиУспешным в предоставлении информации о siRNA-опосредованных изменениях экспрессии генов и определении этапов ограничения скорости 26 . Однако эти модели были применены только к коммерческим системам доставки генов ( например , Lipofectamine и polyethylenimine (PEI)), которые не способны к контролируемому выделению siRNA, и сложность моделей сильно ограничивает их полезность 27 . Эти недостатки подчеркивают неудовлетворенную потребность в новых материалах, способных точно настраивать выпуск siRNA в сочетании с обтекаемыми и простыми в использовании прогнозирующими кинетическими моделями.
Наш метод решает все эти проблемы за счет интеграции светочувствительной платформы нанометрового носителя со связанными методами для количественной оценки свободной сиРНК и динамики модели RNAi. В частности, точно контролируемый siRNA-релиз 28 нашей платформы контролируется двумя дополнительными методами для точного количественного определения инкапсулированных против unСвязанной сиРНК. Экспериментальные данные этих анализов вводятся в простую кинетическую модель для прогнозирования эффективности подавления гена априорно 29 . Наконец, природа включения / выключения нанослоев легко используется для создания структур клеток в экспрессии генов с пространственным контролем на шкале длины клеток. Таким образом, этот метод обеспечивает легко адаптируемый метод контроля и прогнозирования гашения генов в различных приложениях, которые выиграют от пространственно-временной регуляции поведения клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом методе есть несколько шагов, которые особенно важны. При составлении наноугрозов порядок добавления компонентов и скорость смешивания являются двумя важными параметрами, влияющими на эффективность 39 . Этот протокол требует, чтобы катионный компонент, mPEG- b -P (APN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Национальному институту общих медицинских наук Национального института здоровья (NIH) за финансовую поддержку через премию за институциональное развитие (IDeA) под номером гранта P20GM103541, а также номер гранта P20GM10344615. Представленные здесь заявления не отражают взглядов НИЗ. Мы также признаем Делавэрский институт биотехнологии (DBI) и Департамент экономического развития Делавэра (DEDO) за финансовую поддержку через премию Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
