광 반응성 고분자 나노 캐리어로부터의 siRNA 방출의 시공간 조절을 통한 유전자 침묵 예측
Summary
우리는 광 반응성 블록 공중 합체를 사용하는 새로운 방법을 제시한다.이 방법은 검출 불가능한 오프 – 타겟 효과없이 유전자 침묵을보다 효율적으로 공간적으로 제어 할 수있다. 또한 유전자 발현의 변화는 간단한 siRNA 방출 분석 및 간단한 운동 모델링을 사용하여 예측할 수 있습니다.
Abstract
새로운 물질 및 방법은 유전자 활동의 정확한 조절을 필요로하는 광범위한 적용을위한 핵산의 결합 대 방출을보다 잘 제어하기 위해 필요합니다. 특히, 유전자 발현에 대한 시공간적 제어가 개선 된 새로운 자극 – 반응 물질은 약물 발견 및 재생 의학 기술에서 번역 가능한 플랫폼의 잠금을 해제합니다. 또한, 물질로부터의 핵산 방출을 제어하는 능력이 향상되면 나노 캐리어 효능 을 선험적 으로 예측할 수있는 능률적 인 방법의 개발이 가능 해져 배달 차량의 신속한 스크리닝이 가능해진다. 여기, 우리는 유전자 침묵 효율을 예측하고 모듈 식 광 반응성 나노 캐리어 시스템을 통해 유전자 발현에 대한 시공간 제어를 달성하기위한 프로토콜을 제시한다. 작은 간섭 RNA (siRNA)는 mPEG- b -poly (5- (3- (아미노) 프로 폭시) -2- 니트로 벤질 메타 크릴 레이트) (mPEG- β -P (APNBMA)빛으로 조절되어 조정 가능한 ON / OFF siRNA 방출을 촉진 할 수있는 안정한 나노 캐리어입니다. 우리는 세포 내 환경을 모방 솔루션에서 siRNA 릴리스의 정확한 부량을위한 형광 상관 분광법과 겔 전기 영동을 사용하는 두 보완 assays을 설명합니다. 이 분석에서 얻은 정보는 다양한 광 자극 조건에 대한 동적 침묵 반응을 예측하기위한 간단한 RNA 간섭 (RNAi) 동역학 모델에 통합되었습니다. 이어서, 이러한 최적화 된 조사 조건은 시공간적으로 유전자 침묵을 제어하기위한 새로운 프로토콜의 개선을 가능하게했다. 이 방법은 cell-to-cell 분해능과 off-target 효과가없는 유전자 발현의 세포 패턴을 생성 할 수 있습니다. 종합하면, 우리의 접근 방식은 유전자 발현의 역동적 인 변화를 예측하고 시공간적으로 siRNA 활동을 정밀하게 제어 할 수있는 사용하기 쉬운 방법을 제공합니다. 이 assays 세트는 다양한 ot를 테스트하기 위해 쉽게 적용 할 수 있습니다그녀의 자극 반응 시스템은 생물 의학 연구 및 의학 분야의 수많은 어플리케이션과 관련된 핵심 과제를 해결합니다.
Introduction
small interfering RNAs (siRNAs)는 사실상 모든 표적 유전자 1에 대해 매우 특이적이고 강력하며 맞춤형 인 촉매 RNAi 경로를 통해 전사 후 유전자 사일런 싱을 매개한다. 이러한 유망한 특성으로 인해 전이성 흑색 종 및 혈우병을 비롯한 수많은 질병의 치료를위한 인간 임상 시험에서 siRNA 치료제가 발전 할 수있었습니다 2 , 3 . 그러나 번역을 방해하는 중요한 배달 문제가 계속 발생합니다 4 . 특히, 운반체는 안정을 유지해야하며 세포 외 분해로부터 siRNA를 보호해야하며, 또한 세포질에 유핵 적재 물을 방출해야합니다 5 . 또한, 많은 RNAi 응용 프로그램은 siRNA 치료법 7 에서 부작용을 줄이고 변형 가능하게하는 공간 및 시간 6 에서 유전자 침묵을 조절하는 향상된 방법을 필요로합니다.약 발견 8 을위한 세포 microarrays에서 재생성 비계 9 에있는 세포 반응의 조음에 배열하는 신청에있는 dvances. 이러한 과제는 siRNA 나노 캐리어에서 결합 대 방출을보다 잘 제어 할 수있는 새로운 물질 및 방법의 필요성을 강조합니다.
siRNA 방출을 제어하고 시공간 조절을 향상시키는 가장 유망한 전략 중 하나는 자극 반응 물질의 사용입니다 10 . 예를 들어, 생체 물질의 다양한 변화는 핵산 변형 산화 환원 전위 나 산도 또는 자장인가, 초음파 또는 광 (11)에 대응하여 결합 친 화성을 함께 설계 하였다. 이들 시스템 중 다수가 핵산 활성에 대한 개선 된 제어를 입증하지만, 트리거로서의 광의 사용은 순간적 시간 반응, 정확한 공간 분해 및 조율 용이성으로 인해 특히 유리하다 <sup class = "xref"> 12. 또한, 유전자 발현 조절을위한 사진 민감 기술의 잠재력은 최첨단의 유도 성 프로모터 및 광 발생 조절 시스템에 의해 입증되었다. 그러나 이러한 시스템은 내인성 유전자를 규제하기위한 제한된 용량, 면역 원성과 같은 안전성 문제, 다중 부품 조립품의 운반이 어렵다는 것을 비롯하여 수많은 어려움을 겪고 있습니다 13 , 14 , 15 . 광 반응성 siRNA 나노 캐리어는 이러한 결점을 극복하고 유전자 발현을 공간적으로 조절하는보다 간단하고 견고한 접근법을 제공하는데 이상적으로 적합합니다 16 , 17 , 18 . 불행하게도, 결과 단백질의 녹다운 반응을 정확하게 예측하는 방법은 아직 파악하기 어렵습니다.
핵심 과제는 siRNA 방출의 정량적 평가가희귀 19 , 20 및이 평가가 수행 되더라도 siRNA / 단백질 회전율 역학의 분석에 결합되지 않았습니다. siRNA의 방출량과 지속성 / 수명은 생성 된 유전자 침묵 동역학의 중요한 결정 인자입니다. 따라서 그러한 정보가 부족하면 RNAi 21 의 용량 반응의 정확한 예측을 방해하는 주요 단절이 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 nanocarriers의 적절한 구조 함수 관계의 형성을 촉진하고 더 바이오 물질 (22)을 설계 알리는 것이다. 또한, 이러한 접근법은보다 효과적인 siRNA 투약 프로토콜의 개발을 가능하게 할 것이다. 역동적 인 사일런스 반응을 이해하기 위해 여러 그룹이 RNAi 23 , 24 , 25 의 수학적 모델을 조사했습니다. 이 프레임 워크는유전자 발현의 siRNA 매개 된 변화에 대한 통찰력을 제공하고 속도 – 제한 단계 (26)를 식별하는 데 성공. 그러나, 이러한 모델은 제어 siRNA를 방출 할 수없는 상업적인 유전자 전달 시스템 (예를 들어, 리포 펙 타민 및 폴리에틸렌 이민 (PEI))에 적용되어, 상기 모델의 복잡성이 크게 그들의 유틸리티 (27)를 한정하고있다. 이러한 단점은 간결하고 사용하기 쉬운 예측 동역학 모델과 결합하여 정확하게 조정할 수있는 새로운 물질에 대한 충족되지 않은 요구를 강조합니다.
우리의 방법은 빛에 민감한 나노 캐리어 플랫폼과 결합 된 방법을 통합하여 자유로운 siRNA와 모델 RNAi 역학을 정량화함으로써 이러한 모든 문제를 해결합니다. 특히, 우리 플랫폼의 정확하게 제어 된 siRNA 릴리스 28 은 캡슐화 된 대 양성자를 정확하게 정량하기위한 두 가지 보완적인 방법으로 모니터링됩니다결합 된 siRNA. 이 분석에서 실험 데이터는 유전자 침묵 효율성 선험적 (29)을 예측하는 간단한 운동 모델로 입력됩니다. 마지막으로, nanocarriers의 온 / 오프 특성은 쉽게 세포 길이 규모에 공간 제어와 유전자 표현에 세포 패턴을 생성하는 데 활용됩니다. 따라서,이 방법은 세포 행동의 시공간 조절로부터 이익을 얻는 다양한 응용에서 유전자 침묵을 제어 및 예측하는 용이하게 적응 가능한 방법을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법에는 몇 가지 단계가 특히 중요합니다. nanocarriers을 수립 할 때, 구성 요소 추가 및 혼합 속도의 순서는 효능 (39)에 영향을 미치는 두 가지 중요한 매개 변수입니다. 이 프로토콜은 vortexing하는 동안 음이온 성 구성 요소 인 siRNA에 양이온 성 구성 요소 인 mPEG- b -P (APNBMA)가 첨가되도록 요구합니다. 총 배합량에 따라이 혼합 공정은 3-6 초가 소요됩니다. 나노 캐리어가 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 보조금 번호 P20GM103541 및 부여 번호 P20GM10344615로 기관 개발 상 (IDeA)을 통한 재정 지원을 위해 국립 보건원 (NIH)의 국립 종합 의학 연구소에 감사를드립니다. 여기에있는 진술은 NIH의 견해를 반영하지 않습니다. 우리는 또한 첨단 기술 생명 과학 센터 (Bioscience CAT) 상 (12A00448)을 통해 재정 지원을 위해 델라웨어 생명 공학 연구소 (DBI)와 델라웨어 경제 개발 사무소 (DEDO)를 인정합니다.
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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