חיזוי השתקת ג 'ין באמצעות שליטה Spatiotemporal של siRNA שחרור מ תגובה תגובה פולימרית פולימרית
Summary
אנו מציגים שיטה חדשנית המשתמשת קופולימרים לחסום צילום תגובה עבור שליטה יעילה יותר spatiotemporal של השתקת הגן ללא תופעות לזיהוי מחוץ לגילוי. בנוסף, שינויים בביטוי גנים ניתן לחזות באמצעות מבחני שחרור siRNA פשוטים מודלים קינטיים פשוטים.
Abstract
חומרים חדשים ושיטות נדרשים כדי לשלוט טוב יותר מחייב לעומת שחרור של חומצות גרעין עבור מגוון רחב של יישומים הדורשים את הרגולציה המדויקת של פעילות הגן. במיוחד, חומרים חדשים עם תגובה לגירויים עם שליטה משופרת spatiotemporal על ביטוי גנים היה לפתוח פלטפורמות translatable של גילוי תרופות וטכנולוגיות רפואה משובי. יתר על כן, יכולת משופרת לשלוט על שחרור חומצות גרעין מחומרים תאפשר פיתוח של שיטות יעילות לחזות יעילות nanocarrier מראש , מה שמוביל לסקירה מואצת של כלי הלידה. להלן, אנו מציגים פרוטוקול לחיזוי יעילות השתקת גנים והשגת שליטה spatiotemporal על ביטוי גנים באמצעות מודולרי תגובה תגובה nanocarrier המערכת. RNA קטן המפריע (siRNA) הוא מורכב עם mPEG- b- פולי (5- (3 (אמינו) propoxy) -2-nitrobenzyl methacrylate) (mPEG- b -P (APNBMA)) פולימרים כדיRm יציב nanocarriers כי ניתן לשלוט עם אור כדי להקל על מתכוונן, on / off לשחרר siRNA. אנו מתאר שתי מבחני משלימים המעסיקים ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנטי ג 'ל אלקטרופורזה עבור כימות מדויק של שחרור siRNA מ פתרונות חיקוי סביבות תאיים. מידע שנצבר מבחני אלה שולב לתוך הפרעה פשוטה RNAi (מודל RNAi) מודל קינטי לחזות את התגובות דינמי השתקה לתמונות שונות תמריצים התמונה. בתורו, אלה בתנאי הקרנה אופטימיזציה אפשרה חידוד של פרוטוקול חדש לשליטה spatiotemporally השתקת גנים. שיטה זו יכולה ליצור דפוסים סלולריים בביטוי גנים עם רזולוציה תאית לתא ולא תופעות לזיהוי היעד. יחדיו, הגישה שלנו מציעה שיטה קלה לשימוש לניבוי שינויים דינמיים בביטוי גנים ובדיוק שליטה על פעילות siRNA בחלל ובזמן. קבוצה זו של מבחני יכול להיות מותאם בקלות לבחון מגוון רחב של otשלה מגיבים מערכות הגירוי על מנת להתמודד עם אתגרים מרכזיים רלוונטי שפע של יישומים במחקר ביו רפואה ורפואה.
Introduction
קטן RNAs להפריע (siRNAs) לתווך שלאחר השתעת גן השתקה דרך מסלול RNAi קטליטי כי הוא ספציפי מאוד, חזק, ומותאם לכל גן יעד כמעט 1 . המאפיינים המבטיחים הללו אפשרו לתרופה siRNA להתקדם בניסויים קליניים בבני אדם לטיפול במחלות רבות, כולל מלנומה גרורתית ומופיליה 2 , 3 . עם זאת, בעיות משלוח משמעותיות נמשכות כי יש הפרעה תרגום 4 . בפרט, כלי אספקה צריך להישאר יציב ולהגן על siRNAs מ השפלה תאיים, אך גם לשחרר את המטען לתוך הציטופלסמה 5 . יתר על כן, יישומים רבים RNAi דורשים שיטות משופרות כדי להסדיר השתקת גנים בחלל ובזמן 6 , אשר תפחית תופעות לוואי בטיפול siRNA 7 ולאפשר טרנספורמטיביDvances ביישומים החל microarrays תא לגילוי סמים 8 אפנון של תגובות התא רגמות regenerative 9 . אתגרים אלה מדגישים את הצורך בחומרים ושיטות חדשים כדי לשלוט טוב יותר מחייב לעומת שחרור nanocarriers siRNA.
אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר לשליטה שחרור siRNA ושיפור הרגולציה spatiotemporal היא שימוש בחומרים מגיבים תגובה 10 . לדוגמה, מגוון רחב של biomaterials כבר מהונדסים עם שינוי זיקה חומצה גרעין לשינוי בתגובה לשינוי פוטנציאל החמצה או pH, או שדות מגנטיים מיושמים, אולטראסאונד, או אור 11 . למרות שרבות מהמערכות הללו מדגימות בקרה משופרת על פעילות חומצות גרעין, השימוש באור כגורם מפעיל הוא בעל יתרון מיוחד בשל תגובתו הזמנית המיידית, רזולוציה מרחבית מדויקת וקלות <suP class = "xref"> 12. יתר על כן, הפוטנציאל של טכנולוגיות רגישות לתמונות עבור ויסות ביטוי גנטי הוכיח על ידי המדינה- of-the-art מקדם מעורר ומערכות הרגולציה optogenetic; עם זאת, מערכות אלה סובלות מאתגרים רבים, כולל יכולות מוגבלות להסדרת גנים אנדוגניים, בעיות בטיחות כמו immunogenicity, וקשיים באספקה של הרכבות מרובות רכיבים 13 , 14 , 15 . צילום תגובה niocarriers siRNA הם אידיאליים כדי להתגבר על חסרונות אלה ולספק גישה פשוטה יותר חזקים spatiotemporally לווסת ביטוי גנים 16 , 17 , 18 . למרבה הצער, שיטות כדי לחזות במדויק את התגובה החלבון וכתוצאה מכך להישאר חמקמק.
האתגר העיקרי הוא כי הערכות כמותיות של שחרור siRNA הםנדיר 19 , 20 , ואפילו כאשר הערכות אלה מבוצעות, הם לא היו מצמידים לניתוחים של דינמיקה מחזור siRNA / חלבונים. הן כמות siRNA שפורסמו ההתמדה שלה / חיים הם הגורמים החשובים של הדינמיקה השתקת הגן שנוצר; לפיכך, חוסר מידע כזה הוא ניתוק מרכזי המונע חיזוי מדויק של מינון בתגובה RNAi 21 . התמודדות עם אתגר זה היה לזרז את ניסוח של מבנה המתאים תפקוד היחסים nanocarriers ולהודיע טוב יותר עיצובים ביולוגיים 22 . יתר על כן, גישות כאלה יאפשר פיתוח יעיל יותר פרוטוקולי מינון siRNA. בניסיון להבין את תגובת ההשתקה הדינמית, כמה קבוצות חקרו מודלים מתמטיים של RNAi 23 , 24 , 25 . מסגרות אלה היומוצלח במתן תובנות לשינויים בתיווך siRNA בביטוי גנטי וזיהוי צעדים להגבלת שיעור 26 . עם זאת, מודלים אלה יושמו רק על מערכות מסחריות של אספקת גנים ( למשל , Lipofectamine ו- polyethylenimine (PEI)) שאינם מסוגלים לשחרור siRNA מבוקר, והמורכבות של המודלים הגבילה מאוד את תועלתם 27 . חסרונות אלה מדגישים צורך בלתי מסופק עבור חומרים חדשים המסוגלים לשחרר siRNA מתכוונן בדיוק משולב עם מודלים קינטיים יעיל מנבא וקל לשימוש.
השיטה שלנו כתובות את כל האתגרים הללו באמצעות שילוב של פלטפורמה nanocarrier רגיש לאור עם שיטות מצמידים לכמת חינם siRNA מודל RNAi דינמיקה. בפרט, פלטפורמה SiRNA שלנו נשלט בדיוק של פלטפורמה 28 הוא פיקוח על ידי שתי שיטות משלימות לכימות מדוייק encapsulated לעומת unSiRNA כבול. הנתונים הניסוייים של מבחני אלה הם נכנסו מודל קינטי פשוט לחזות יעילות השתקת גנים מראש 29 . לבסוף, את on / off הטבע של nanocarriers הוא ניצל בקלות כדי ליצור דפוסי תאים ביטוי גנים עם שליטה מרחבית על אורך הסלולרי. לכן, שיטה זו מספקת שיטה להתאמה בקלות לשלוט ולחזות השתקת גנים במגוון של יישומים אשר ייהנו רגולציה spatiotemporal של התנהגות התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים בשיטה קריטיים במיוחד. כאשר ניסוח nanocarriers, את הסדר של תוספת רכיב מהירות ערבוב הם שני פרמטרים חשובים המשפיעים על יעילות 39 . פרוטוקול זה דורש כי רכיב cationic, mPEG- b- AP (APNBMA), נוסף מרכיב anionic, siRNA, בצורה dropwise בזמן vortexing. בהתאם נפח ניסוח הכולל, תהליך ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למוסד הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) לתמיכה כספית באמצעות פרס פיתוח מוסדי (IDeA) תחת מספר מענק P20GM103541 וכן מענק מספר P20GM10344615. ההצהרות המובאות כאן אינן משקפות את עמדות ה – NIH. כמו כן, אנו מכירים את המכון הביוטכנולוגי של דלאוור (DBI) ואת משרד הפיתוח הכלכלי של דלאוור (DEDO) לתמיכה כספית באמצעות פרס המרכז למדעי החיים (Bioscience CAT) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
