Vorhersage des Gen-Silens durch die räumlich-zeitliche Kontrolle der siRNA-Freisetzung von photoreaktiven polymeren Nanocarriern
Summary
Wir stellen eine neuartige Methode vor, die photoempfindliche Blockcopolymere für eine effizientere räumlich-zeitliche Kontrolle von Gen-Silencing ohne nachweisbare Off-Target-Effekte verwendet. Zusätzlich können Veränderungen in der Genexpression unter Verwendung einfacher siRNA-Freisetzungsassays und einfacher kinetischer Modellierung vorhergesagt werden.
Abstract
Neue Materialien und Methoden sind erforderlich, um die Bindung gegen die Freisetzung von Nukleinsäuren für eine breite Palette von Anwendungen, die die genaue Regulation der Genaktivität erfordern, besser zu kontrollieren. Insbesondere würden neuartige stimuli-reaktionsfähige Materialien mit einer verbesserten räumlich-zeitlichen Kontrolle über die Genexpression verschiebbare Plattformen in der Wirkstoffforschung und der regenerativen Medizintechnologie freischalten. Darüber hinaus würde eine verbesserte Fähigkeit, die Nucleinsäure-Freisetzung aus Materialien zu kontrollieren, die Entwicklung von stromlinienförmigen Verfahren ermöglichen, um die Nanokarrier-Wirksamkeit a priori vorherzusagen, was zu einem beschleunigten Screening von Lieferfahrzeugen führt. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Vorhersage von Gen-Silencing-Effizienzen und zur Erzielung einer räumlich-zeitlichen Kontrolle über die Genexpression durch ein modulares photoempfindliches Nanocarrier-System. Kleine interferierende RNA (siRNA) wird mit mPEG- b- Poly (komplexen (5- (3- (Amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylat) (mPEG- b- P (APNBMA)) -Polymeren zu foRm stabile Nanocarrier, die mit Licht gesteuert werden können, um einstellbares, on / off siRNA Release zu ermöglichen. Wir skizzieren zwei komplementäre Assays mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie und Gelelektrophorese für die genaue Quantifizierung der siRNA-Freisetzung aus Lösungen, die intrazelluläre Umgebungen nachahmen. Informationen, die aus diesen Assays gewonnen wurden, wurden in ein einfaches RNA-Interferenz- (RNAi) -Kinetikmodell eingearbeitet, um die dynamischen Stummschaltungsreaktionen auf verschiedene Photo-Stimulus-Bedingungen vorherzusagen. Im Gegenzug ermöglichten diese optimierten Bestrahlungsbedingungen die Verfeinerung eines neuen Protokolls zur räumlich-zeitlichen Steuerung von Gen-Silencing. Diese Methode kann zelluläre Muster in der Genexpression mit Zell-zu-Zell-Auflösung und keine nachweisbaren Off-Target-Effekte erzeugen. Zusammenfassend bietet unser Ansatz eine einfach zu bedienende Methode zur Vorhersage dynamischer Veränderungen der Genexpression und zur präzisen Steuerung der siRNA-Aktivität in Raum und Zeit. Dieser Satz von Assays kann leicht angepasst werden, um eine breite Vielfalt von ot zu testenIhre stimuli-reaktionsfähigen Systeme, um die wichtigsten Herausforderungen zu adressieren, die für eine Vielzahl von Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und Medizin relevant sind.
Introduction
Kleine interferierende RNAs (siRNAs) vermitteln das posttranskriptionelle Gen-Silencing durch einen katalytischen RNAi-Weg, der hochspezifisch, potent und maßgeschneidert für nahezu jedes Zielgen 1 ist . Diese vielversprechenden Eigenschaften haben es ermöglicht, dass siRNA-Therapeutika in menschlichen klinischen Studien zur Behandlung zahlreicher Krankheiten, einschließlich metastasiertem Melanom und Hämophilie 2 , 3 vorankommen. Allerdings bestehen erhebliche Lieferprobleme, die die Übersetzung behindert haben 4 . Insbesondere müssen Lieferfahrzeuge stabil bleiben und siRNAs vor extrazellulärem Abbau schützen und dennoch die Nutzlast in das Zytoplasma 5 freisetzen. Darüber hinaus erfordern viele RNAi-Anwendungen verbesserte Methoden zur Regulierung der Gen-Silencing in Raum und Zeit 6 , die Nebenwirkungen in siRNA-Therapeutika reduzieren 7 und ermöglichen transformative aDvances in Anwendungen von Zell-Mikroarrays für die Wirkstoffforschung 8 bis hin zur Modulation von Zellreaktionen in regenerativen Gerüsten 9 . Diese Herausforderungen unterstreichen die Notwendigkeit neuer Materialien und Methoden zur besseren Kontrolle der Bindung gegenüber der Freisetzung in siRNA-Nanocarrier.
Eine der vielversprechendsten Strategien zur Kontrolle der siRNA-Freisetzung und zur Verbesserung der räumlich-zeitlichen Regulierung ist der Einsatz von stimuli-reaktionsfähigen Materialien 10 . Beispielsweise wurde eine Vielzahl von Biomaterialien mit einer veränderlichen Nukleinsäure-Bindungsaffinität in Reaktion auf verändertes Redoxpotential oder pH-Wert oder angewandte Magnetfelder, Ultraschall oder Licht 11 entwickelt . Obwohl viele dieser Systeme eine verbesserte Kontrolle über die Nukleinsäureaktivität zeigen, ist die Verwendung von Licht als Trigger besonders vorteilhaft aufgrund seiner augenblicklichen zeitlichen Reaktion, der präzisen räumlichen Auflösung und der Leichtigkeit der Abstimmbarkeit <suP class = "xref"> 12. Darüber hinaus wurde das Potenzial von photoempfindlichen Technologien zur Regulierung der Genexpression durch modernste induzierbare Promotor- und optogenetische Regulierungssysteme nachgewiesen; Diese Systeme leiden jedoch unter zahlreichen Herausforderungen, einschließlich begrenzter Kapazitäten zur Regulierung endogener Gene, Sicherheitsbedenken wie Immunogenität und Schwierigkeiten bei der Bereitstellung von Mehrkomponenten-Baugruppen 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA-Nanocarrier sind ideal geeignet, um diese Nachteile zu überwinden und bieten einen einfacheren und robusteren Ansatz zur räumlich-modulierenden Genexpression 16 , 17 , 18 . Leider sind Methoden zur genauen Vorhersage der resultierenden Protein-Knockdown-Antwort unklar.
Eine zentrale Herausforderung ist, dass quantitative Auswertungen der siRNA-Freisetzung sindSelten 19 , 20 , und selbst wenn diese Auswertungen durchgeführt werden, wurden sie nicht mit Analysen der siRNA / Protein-Umsatzdynamik gekoppelt. Sowohl die Menge an siRNA freigesetzt als auch ihre Persistenz / Lebensdauer sind wichtige Determinanten der resultierenden Gen-Silencing-Dynamik; Daher ist ein Mangel an solchen Informationen eine große Trennung, die eine genaue Vorhersage der Dosis-Antwort in RNAi 21 ausschließt . Die Auseinandersetzung mit dieser Herausforderung würde die Formulierung der entsprechenden Struktur-Funktions – Beziehungen in Nanocarriern beschleunigen und besser informieren Biomaterial 22 – Design. Darüber hinaus würden solche Ansätze die Entwicklung von effektiveren siRNA-Dosierungsprotokollen ermöglichen. In einem Versuch, die dynamische Stummschaltung zu verstehen, haben mehrere Gruppen mathematische Modelle von RNAi 23 , 24 , 25 untersucht . Diese Rahmenbedingungen warenErfolgreich bei der Bereitstellung von Einsichten in siRNA-vermittelte Veränderungen in der Genexpression und zur Ermittlung der Geschwindigkeitsbegrenzungsschritte 26 . Diese Modelle wurden jedoch nur auf kommerzielle Genabgabesysteme ( z. B. Lipofectamin und Polyethylenimin (PEI)) angewendet, die nicht in der Lage sind, eine siRNA-Freisetzung zu kontrollieren, und die Komplexität der Modelle hat ihre Nützlichkeit stark eingeschränkt 27 . Diese Mängel unterstreichen einen unerfüllten Bedarf an neuen Materialien, die in der Lage sind, eine genau abstimmbare siRNA-Freisetzung zu kombinieren, kombiniert mit stromlinienförmigen und einfach zu bedienenden prädiktiven kinetischen Modellen.
Unsere Methode adressiert alle diese Herausforderungen durch die Integration einer lichtempfindlichen Nanocarrier-Plattform mit gekoppelten Methoden zur Quantifizierung der freien siRNA und Modell-RNAi-Dynamik. Insbesondere wird die präzise kontrollierte siRNA-Freigabe 28 unserer Plattform durch zwei komplementäre Methoden zur genauen Quantifizierung von verkapselten vs. un überwachtGebundene siRNA. Die experimentellen Daten aus diesen Tests werden in einem einfachen kinetischen Modell eingegeben gene silencing Effizienzen a priori 29 vorherzusagen. Schließlich wird die On / Off-Natur der Nanocarrier leicht ausgenutzt, um Zellmuster in der Genexpression mit räumlicher Kontrolle auf der zellulären Längenskala zu erzeugen. Somit bietet dieses Verfahren ein leicht anpassbares Verfahren zur Steuerung und Vorhersage von Gen-Silencing in einer Vielzahl von Anwendungen, die von einer räumlich-zeitlichen Regulierung des Zellverhaltens profitieren würden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt ein paar Schritte in der Methode, die besonders kritisch sind. Bei der Formulierung der Nanocarrier sind die Reihenfolge der Komponentenaddition und der Mischgeschwindigkeit zwei wichtige Einflussfaktoren für die Wirksamkeit 39 . Dieses Protokoll erfordert, dass die kationische Komponente, mPEG- b -P (APNBMA), der anionischen Komponente, siRNA, tropfenweise unter Vortexen zugesetzt wird. Je nach Formulierungsvolumen dauert dieser Mischvorgang 3-6 s. Um zu testen, ob die Nanocarr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken dem Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health (NIH) für die finanzielle Unterstützung durch einen Institutional Development Award (IDeA) unter der Nummer P20GM103541 sowie der Nummer P20GM10344615. Die hierin enthaltenen Aussagen spiegeln nicht die Ansichten des NIH wider. Wir bestätigen auch das Delaware Biotechnology Institute (DBI) und das Delaware Economic Development Office (DEDO) für die finanzielle Unterstützung durch den Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) Award (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
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