Een Unified Methodological Framework voor Vestibular Schwannoma Research

Summary

Het doel van dit protocol is het samenstellen en verwerken van menselijke chirurgische monsters voor meerdere downstream toepassingen in vestibulaire schwannoma- en Schwann-celonderzoek.

Abstract

Vestibulaire schwannomen zijn de meest voorkomende neoplasma's van de cerebellopontinehoek, die 6-8% van alle intracraniale groeizen vormen. Hoewel deze tumoren sensorineuraal gehoorverlies veroorzaken in 95% van de getroffen individuen, blijven de moleculaire mechanismen die tot dit gehoorverlies leiden, onduidelijk. Dit artikel schetst de stappen in ons laboratorium om de inzameling en verwerking van diverse primaire menselijke weefselmonsters te vergemakkelijken voor downstream onderzoeksapplicaties die integraal zijn bij de studie van vestibulaire schwannomen. Specifiek beschrijft dit werk een verenigd methodologisch kader voor de verzameling, verwerking en cultuur van Schwann- en schwannomacellen uit chirurgische monsters. Dit is geïntegreerd met parallelle verwerkingsstappen die nu essentieel zijn voor huidig ​​onderzoek: de verzameling van tumor- en zenuwafscheidingen, het behoud van RNA en de extractie van eiwitten uit verzamelde weefsels, de fixatie van weefsel voor de bereiding van secties, eenD de blootstelling van primaire humane cellen aan adeno-geassocieerde virussen voor toepassing op gentherapie. Daarnaast benadrukt dit werk de translabyrinthine chirurgische benadering om deze tumor te verzamelen als een unieke kans om menselijk zintuiglijk epitheel van het binnenoor en periliem te verkrijgen. Tips voor het verbeteren van de experimentele kwaliteit worden verstrekt en gemeenschappelijke valkuilen worden gemarkeerd.

Introduction

Vestibulaire schwannomen (VS's) zijn de meest voorkomende neoplasma's van de cerebellopontinehoek, gediagnosticeerd bij 1 op elke 100.000 individuen. Hoewel niet-metastatische, beïnvloeden deze tumoren een levenskwaliteit van een patiënt ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} ernstig. Geïnteresseerden leven meestal met gehoorverlies, tinnitus en een gevoel van gehoorvervulling. Symptomen worden steeds meer belemmerend aangezien de tumor groeit, waardoor balansproblemen, gelaatsverlamming en vermindering van andere craniale zenuwfuncties ontstaan. Levensbedreigende complicaties als gevolg van hersenstam compressie kunnen ook ⁷ opleveren.

Beheersopties voor VS zijn in wezen beperkt tot waakzaam wachten op statische tumoren en stereotactische radiotherapie of chirurgische resectie voor groeiende tumoren <sUp class = "xref"> 8. De chirurgische verwijdering van deze tumoren in onderzoeksgebonden ziekenhuizen biedt de mogelijkheid om vers tumorweefsel te verzamelen en te analyseren die tijdens de patiëntenoperaties worden verzameld. Een specifieke chirurgische benadering van VS, de translabyrinthine resectie, kan zelfs toegang bieden tot waardevolle menselijke zintuiglijke epithelium uit het binnenoor en periliem.

Omdat VS's voortkomen uit een perifere sensorische zenuw ( dwz de vestibulaire zenuw), is het belangrijk om VS-geassocieerde waarnemingen te vergelijken met die afgeleid van een passende controlevenuwe, zoals de menselijke grote auriculaire zenuw (GAN). Gezonde GAN's worden regelmatig geofferd tijdens parotidectomies of nekdissecties en kunnen gebruikt worden als robuuste modellen voor gezonde Schwann-celfysiologie ⁹ .

Omdat er geen FDA-goedgekeurde geneesmiddelen zijn voor de behandeling of preventie van sporadische VS, is het essentieel dat onderzoekers de onderliggende moleculaire mecha verduidelijkenNismen van de ziekte ter identificatie van therapeutische doelen. Proteïnen die zijn aangetoond dat ze een rol spelen in de VS-pathogenese, omvatten merlin, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), cyclooxygenase 2 (COX-2), nucleaire factor kappa B (NF-KB), tumornekrosefactor alfa (TNF-alpha) , Epidermale groeifactorreceptor (EGFR) en verwante signaleringsmoleculen ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17} .

Recente vooruitgang heeft uitgebreid en verbeterde protocollen voor het verzamelen, verwerken, culturen en stroomafwaarts onderzoek van primaire humane vestibulaire schwannomen en gezonde zenuwweefsels ^{18 , 19} . De meeste bestaande protocollen zijn echter ontworpen om de voorbereiding op te nemenAtion van dergelijke weefsels voor een enkele stroomafwaartse onderzoeksaanvraag ( dwz alleen celcultuur). Dit artikel bevat een uniforme methodologische kader voor de gelijktijdige verwerking van een enkelvoudig primair menselijk VS- of GAN-monster voor meerdere downstream toepassingen: celtype-specifieke cultuur, eiwit-extractie, RNA-behoud, insameling van tumorenecretie en weefselfixatie. Dit werk bevat ook details over de chirurgische insameling en verwerking van menselijke cerebrospinale vloeistof (CSF) en periliem tijdens transplantabyrinthine VS resectie, aangezien deze nauw verwante weefsels kunnen dienen als belangrijke bronnen van biomarkers voor VS. Tenslotte presenteert dit protocol stappen voor de virale transductie van primaire menselijke VS-cellen in cultuur als een nieuwe toepassing van dit weefsel voor gebruik bij gentherapie.

Protocol

Schriftelijk geïnformeerde toestemming voor de verzameling van alle monsters is verkregen voorafgaand aan de operatie, en de experimenten werden uitgevoerd volgens de Ethische Code van de Wereld Medische Vereniging (Verklaring van Helsinki). Alle afdelingen van het studieprotocol werden goedgekeurd door de Institutional Review Board van Massachusetts Eye and Ear en Massachusetts General Hospital. OPMERKING: De secties 1-7 hieronder zijn ontworpen om achtereenvolgens te worden uitgevoerd bij…

Representative Results

Primaire menselijke VS-cellen in cultuur, zoals vastgesteld in sectie 5, kunnen in veel downstream-onderzoeksaanvragen als informatieve modellen voor ziekteverwante processen worden behandeld ( Figuur 1 ). Gezonde Schwann-cellen die in sectie 6 zijn gekweekt, geven een direct en leerzaam vergelijkingspunt. Zoals hieronder uiteengezet, zijn uitgebreide gegevens van VS's en GAN's verwerkt volgens dit verenigde methodologische kader beschikbaar in meerd…

Discussion

Dit manuscript beschrijft een verenigd methodologisch kader voor VS-onderzoek, waarin de gelijktijdige verwerking van menselijke VS- en GAN-monsters wordt beschreven voor downstream onderzoeksoepassingen. Aangezien VS-onderzoek de leeftijd van precisie geneeskunde oplevert, kan het opstellen van hetzelfde monster in formulieren die veel onderzoeksvragen kunnen beantwoorden, de detectie van moleculaire, cellulaire, genetische en proteomische inzichten die specifiek zijn voor individuele patiënten, mogelijk maken.

<p…

Materials

BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip	Corning	354087	Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	188161
CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile	Greiner Bio-One	227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered	Sigma-Aldrich	C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile	Corning	3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Thermo Fisher Scientific	D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10313-039
DMEM/F-12, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel	Fine Science Tools	11231-30	Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox	Fine Science Tools	11251-20	Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10437-028	Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder	Sigma-Aldrich	H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile	EMD Millipore	SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline	Sigma-Aldrich	P6148	Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 ml	Thermo Fisher Scientific	10010-023	Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml	Thermo Fisher Scientific	15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets	Roche	04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets	Thermo Fisher Scientific	88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml	Variable	Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes	E&K Scientific	EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in	BD	301629
RIPA Buffer	Boston BioProducts	BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution)	Thermo Fisher Scientific	AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml	Eppendorf	022363719	Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml	Eppendorf	022363204	Autoclave prior to use
Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml	Hospira	0409-1966-05
Scalpel Blades – #15	Fine Science Tools	10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge	Bausch + Lomb	N1698 42	Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ	Medline	DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope	Zeiss	000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in.	BD	309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml	BD	309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml	BD	309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe	Cole-Parmer	CP25013