Ein einheitlicher methodischer Rahmen für die vestibuläre Schwannomforschung
Summary
Ziel dieses Protokolls ist es, die Erfassung und Verarbeitung von humanen chirurgischen Proben für mehrere nachgeschaltete Anwendungen im vestibulären Schwannom und Schwann Zellforschung zu skizzieren.
Abstract
Vestibuläre Schwannome sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontinwinkels, was 6-8% Prozent aller intrakraniellen Wucherungen ausmacht. Obwohl diese Tumore einen sensorineuralen Hörverlust bei bis zu 95% der betroffenen Personen verursachen, bleiben die molekularen Mechanismen, die diesem Hörverlust zugrunde liegen, unklar. Dieser Artikel beschreibt die Schritte in unserem Labor, um die Sammlung und Verarbeitung von verschiedenen primären menschlichen Gewebe Proben für nachgeschaltete Forschungs-Anwendungen integral in die Studie der vestibulären Schwannome zu erleichtern. Speziell beschreibt diese Arbeit einen einheitlichen methodischen Rahmen für die Sammlung, Verarbeitung und Kultur von Schwann und Schwannomzellen aus chirurgischen Proben. Hierbei handelt es sich um parallele Verarbeitungsschritte, die für die aktuelle Forschung als wesentlich erachtet werden: die Sammlung von Tumor- und Nervensekreten, die Erhaltung der RNA und die Extraktion von Protein aus gesammelten Geweben, die Fixierung von Gewebe zur Vorbereitung von Abschnitten,D die Exposition von primären menschlichen Zellen zu Adeno-assoziierten Viren für die Anwendung auf Gentherapie. Darüber hinaus hebt diese Arbeit den translabyrinthischen chirurgischen Ansatz hervor, um diesen Tumor als eine einmalige Gelegenheit zu erhalten, menschliches sensorisches Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph zu erhalten. Tipps zur Verbesserung der experimentellen Qualität werden zur Verfügung gestellt und häufige Fallstricke hervorgehoben.
Introduction
Vestibuläre Schwannome (VSs) sind die häufigsten Neubildungen des Cerebellopontin-Winkels, diagnostiziert in 1 bei jedem 100.000 Individuen. Obwohl nicht-metastatisch, diese Tumoren stark beeinflussen die Lebensqualität eines Patienten 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Betroffene Personen leben gewöhnlich mit Hörverlust, Tinnitus und einem Gefühl der akustischen Fülle. Die Symptome werden zunehmend schwächenden, wenn der Tumor wächst, was Balanceprobleme, Gesichtslähmung und Beeinträchtigung anderer Hirnnervenfunktionen verursacht. Lebensbedrohliche Komplikationen durch Hirnstammkompression können ebenfalls auftreten 7 .
Management-Optionen für VS sind im Wesentlichen auf wachsames Warten auf statische Tumoren und stereotaktische Strahlentherapie oder chirurgische Resektion für wachsende Tumoren beschränkt <sUp class = "xref"> 8. Die chirurgische Entfernung dieser Tumore in forschungsbezogenen Krankenhäusern bietet die Möglichkeit, frisches Tumorgewebe zu erwerben und zu analysieren, das während der Patientenchirurgie gesammelt wurde. Ein spezifischer chirurgischer Ansatz für VS, die translabyrinthische Resektion, kann sogar den Zugang zu wertvollem menschlichem sensorischen Epithel aus dem Innenohr und der Perilymph
Weil VSs aus einem peripheren Sinnesnerv ( dh dem Vestibularis) entstehen, ist es wichtig, VS-assoziierte Beobachtungen mit denen zu vergleichen, die von einem geeigneten Kontrollnerv abgeleitet sind, wie dem menschlichen Nervenvenen (GAN). Gesunde GANs werden regelmäßig bei Parotidektomien oder Halsdissektionen geopfert und können als robuste Modelle für eine gesunde Schwann-Zellphysiologie verwendet werden 9 .
Da es keine FDA-zugelassenen Medikamente für die Behandlung oder Prävention von sporadischen VS gibt, ist es zwingend erforderlich, dass Forscher die zugrunde liegenden molekularen Mecha aufklärenNismen der Krankheit, um therapeutische Ziele zu identifizieren. Proteine, die gezeigt haben, dass sie eine Rolle bei der VS-Pathogenese spielen, umfassen Merlin, vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Cyclooxygenase 2 (COX-2), Kernfaktor Kappa B (NF- & kgr; B), Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) , Epidermaler Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und verwandte Signalmoleküle 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Jüngste Fortschritte haben erweitert und verbesserte Protokolle für die Sammlung, Verarbeitung, Kultur und nachgelagerte Untersuchung von primären menschlichen vestibulären Schwannomen und gesunden Nervengeweben 18 , 19 . Allerdings sind die meisten bestehenden Protokolle entworfen, um die Vorbereitung unterzubringenVon solchen Geweben für eine einzige nachgeschaltete Forschungsapplikation ( dh Zellkultur allein). Dieser Artikel stellt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die gleichzeitige Verarbeitung einer einzelnen primären menschlichen VS- oder GAN-Probe für mehrere nachgeschaltete Anwendungen dar: Zelltypspezifische Kultur, Proteinextraktion, RNA-Konservierung, Tumorsekretionsansammlung und Gewebefixierung. Diese Arbeit beschreibt auch die chirurgische Sammlung und Verarbeitung von menschlicher Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) und Perilymph während der translabyrinthischen VS-Resektion, da diese eng verwandten Gewebe als wichtige Quellen für Biomarker für VS dienen können. Schließlich stellt dieses Protokoll Schritte für die virale Transduktion von primären menschlichen VS-Zellen in Kultur als eine neuartige Anwendung dieses Gewebes für die Verwendung in der Gentherapie vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt einen einheitlichen methodischen Rahmen für die VS-Forschung und skizziert die gleichzeitige Verarbeitung von menschlichen VS- und GAN-Proben für nachgeschaltete Forschungsanwendungen. Da die VS-Forschung das Alter der Präzisionsmedizin betritt, wird die Vorbereitung der gleichen Probe in Formen, die in der Lage sind, zahlreiche Forschungsfragen zu beantworten, die Entdeckung molekularer, zellularer, genetischer und proteomischer Erkenntnisse, die für einzelne Patienten spezifisch sind, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und andere Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (unterstützt JES und SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-14-1-0091 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS) , Die Nancy Sayles Day Foundation (KMS), das Lauer Tinnitus Research Center (KMS) und die Barnes Foundation (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
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