Vestibüler Schwannoma Araştırması İçin Birleştirilmiş Metodolojik Çerçeve
Summary
Bu protokolün amacı, vestibüler schwannoma ve Schwann hücresi araştırmalarında birden fazla aşağı akım uygulaması için insan cerrahi numunelerinin toplanması ve işlenmesinin ana hatlarını vermektir.
Abstract
Vestibüler schwannomalar, serebelopontin açıdaki en yaygın neoplazmlardır ve tüm intrakranyal büyümelerin% 6-8'ini oluştururlar. Bu tümörler, etkilenen bireylerin% 95'ine kadar sensörinöral işitme kaybına neden olsa da, işitme kaybının altında yatan moleküler mekanizmalar kaçınılmazdır. Bu makale, laboratuarımızda, vestibüler schwannomaların çalışmasına ayrık akışaşağı araştırma uygulamaları için çeşitli birincil insan dokusu örneklerinin toplanmasını ve işlenmesini kolaylaştırmak için kurulmuş olan adımları özetlemektedir. Özellikle, bu çalışma, cerrahi numunelerdeki Schwann ve schwannoma hücrelerinin toplanması, işlenmesi ve kültürü için birleşik bir metodolojik çerçeve tanımlamaktadır. Bu, şu anki araştırmalar için gerekli görülen paralel proses adımlarıyla bütünleşmiştir: tümör ve sinir salgılarının toplanması, RNA'nın korunması ve toplanan dokulardan protein ekstraksiyonu, bölümlerin hazırlanması için doku fiksasyonu,Primer insan hücrelerinin gen tedavisine uygulanması için adeno-ilişkili virüslere maruz kalması. Ek olarak, bu çalışma, bu tümörü, iç kulaktan ve perilymftten insan sensory epitelini elde etmek için eşsiz bir fırsat olarak toplamak için translabyrinthine cerrahi yaklaşımı vurgular. Deneysel kaliteyi artırmak için ipuçları sağlanmaktadır ve vurgulanılan yaygın tuzaklar bulunmaktadır.
Introduction
Vestibüler schwannomalar (VS), her 100.000 kişiden 1 tanesinde serebellopontin açılarının en sık rastlanan neoplazmıdır. Metastatik olmamasına rağmen, bu tümörler bir hastanın yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Etkilenen kişiler genellikle işitme kaybı, kulak çınlaması ve işitme hissi ile yaşar. Belirtileri, tümör büyüdükçe denge sorunları, yüz felci ve diğer kraniyal sinir fonksiyonlarının bozulmasına yol açarak giderek zayıflamaya başlar. Beyin sapı kompresyonuna bağlı yaşamı tehdit eden komplikasyonlar da oluşabilir 7 .
VS için yönetim seçenekleri esasen statik tümörleri beklemek ve stereotaktik radyasyon tedavisi veya büyümekte olan tümörler için cerrahi rezeksiyon ile sınırlıdır <sUp class = "xref"> 8. Araştırmaya bağlı hastanelerde bu tümörlerin cerrahi olarak çıkarılması, hasta ameliyatları sırasında toplanan taze tümör dokusunu edinme ve analiz etme olanağı sunar. Translabirüsin rezeksiyonu olan, VS'ye spesifik bir cerrahi yaklaşım dahili kulaktan ve perilymfden değerli insan sensoryum epiteline ulaşmayı sağlayabilir.
VS'ler periferik bir duyu sinirinden ( yani, vestibüler sinir) kaynaklandığından VS ile ilişkili gözlemlerin, insan büyük auriküler sinir (GAN) gibi uygun bir kontrol sinirinden elde edilen gözlemlerle karşılaştırılması önemlidir. Sağlıklı GAN'lar parotidektomi veya boyun diseksiyonu sırasında düzenli olarak feda edilir ve sağlıklı Schwann hücre fizyolojisi için sağlam modeller olarak kullanılabilir 9 .
Sporadik VS'nin tedavisi veya önlenmesi için FDA onaylı herhangi bir ilaç bulunmadığından, araştırmacıların altta yatan moleküler meşeyi aydınlatması zorunludurTerapötik hedefleri belirlemek için hastalığın nismleri. VS patogenezinde rol oynadığı gösterilen proteinler merlin, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), siklooksigenaz 2 (COX-2), nükleer faktör kappa B (NF-κB), tümör nekroz faktör alfa (TNF-alfa) , Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve ilgili sinyal molekülleri olan 10,11,12,13,14,15,16,17 .
Yakın zamandaki ilerlemeler, birincil insan vestibüler schwannomaları ve sağlıklı sinir dokularının toplanması, işlenmesi, kültürü ve alt başlarında araştırılması için protokoller geliştirilmiş ve geliştirilmiş 18,19. Bununla birlikte, mevcut protokollerin çoğunun, preparatın( Örn . Tek başına hücre kültürü) için bu tür dokuların atılması. Bu makale, hücre tipi-spesifik kültür, protein ekstraksiyonu, RNA korunumu, tümör salgı toplama ve doku fiksasyonu gibi birçok alt akış uygulamaları için tek bir birincil insan VS veya GAN örneğinin aynı anda işlenmesi için birleşik bir metodolojik çerçeve sunmaktadır. Bu çalışma ayrıca, translabyrinthine VS reseksiyonu esnasında insan beyin-omurilik sıvısının (CSF) ve perilymfinin cerrahi olarak toplanması ve işlenmesi hakkında detaylı bilgi vermektedir, çünkü bu yakından ilişkili dokular VS için biyolojik belirteç kaynakları olarak hizmet edebilir. Sonunda, bu protokol, gen terapisinde kullanılmak üzere bu dokunun yeni bir uygulaması olan kültürdeki birincil insan VS hücrelerinin viral iletimi için adımlar sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu el yazması, VS araştırması için birleştirilmiş bir metodolojik çerçeve tanımlamakta ve insan VS ve GAN numunelerinin akış aşağısı araştırma uygulamaları için eş zamanlı işlenmesini özetlemektedir. VS araştırması hassas tıbbın yapıldığı çağa girerken, aynı örneği çok sayıda araştırma sorusuna cevap verebilecek formlarda hazırlamak, bireysel hastalara özgü moleküler, hücresel, genetik ve proteomik görüşlerin keşfedilmesine olanak tanır.
İ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Sağırlık ve Diğer İletişim Bozuklukları Ulusal Araştırma Enstitüsü tarafından R01DC015824 (KMS) ve T32DC00038 (JES ve SD'yi destekliyor), Savunma Bakanlığı hibe W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Vakfı (KMS) , Nancy Sayles Günü Vakfı (KMS), Lauer Tinnitus Araştırma Merkezi (KMS) ve Barnes Vakfı (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma?. Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma?. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
