En enhetlig metodologisk ram för Vestibular Schwannoma Research
Summary
Målet med detta protokoll är att skissera samlingen och behandlingen av mänskliga kirurgiska prover för flera nedströmsapplikationer i vestibulär schwannom och Schwann-cellforskning.
Abstract
Vestibulära schwannomer är de vanligaste neoplasma av cerebellopontinvinkeln, vilket utgör 6-8% av alla intrakraniella tillväxter. Även om dessa tumörer orsakar sensorineural hörselnedsättning i upp till 95% av de drabbade individerna, förblir de molekylära mekanismerna som ligger till grund för denna hörselnedsättning förvirrande. Denna artikel beskriver de steg som fastställts i vårt laboratorium för att underlätta insamling och behandling av olika primära humana vävnadsprover för nedströms forskningsapplikationer som är integrerade i studien av vestibulära schwannom. Specifikt beskriver detta arbete ett enhetligt metodiskt ramverk för insamling, bearbetning och odling av Schwann- och schwannomaceller från kirurgiska prover. Detta är integrerat med parallella behandlingssteg som nu anses nödvändiga för aktuell forskning: insamling av tumör- och nervsekretioner, bevarande av RNA och extraktion av protein från uppsamlade vävnader, fixering av vävnad för framställning av sektioner, enD exponering av primära humana celler på adeno-associerade virus för applicering på genterapi. Dessutom framhäver detta arbete det translabyrintiska kirurgiska sättet att samla denna tumör som en unik möjlighet att erhålla mänskligt sensoriskt epitel från inre örat och perilimf. Tips för att förbättra experimentell kvalitet tillhandahålls och vanliga fallgropar framhävs.
Introduction
Vestibulära schwannom (VS) är de vanligaste neoplasma av cerebellopontinvinkeln, diagnostiserad hos 1 av 100 000 individer. Även om de inte är metastatiska, påverkar dessa tumörer allvarligt en patients livskvalitet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Berörda individer lever vanligen med hörselnedsättning, tinnitus och en känsla av ljudfylldhet. Symtom blir alltmer försvagande när tumören växer, vilket orsakar balansproblem, ansiktsförlamning och försämring av andra kranialnervfunktioner. Livshotande komplikationer på grund av hjärnstammens kompression kan också medföra 7 .
Förvaltningsalternativ för VS är väsentligen begränsad till vaksam väntan på statiska tumörer och stereotaktisk strålbehandling eller kirurgisk resektion för växande tumörer <sUp class = "xref"> 8. Det kirurgiska avlägsnandet av dessa tumörer i forskningsrelaterade sjukhus ger möjlighet att förvärva och analysera färskt tumörvävnad som samlats under patientoperationer. Ett specifikt kirurgiskt tillvägagångssätt för VS, den translabyrintiska resektionen, kan till och med erbjuda tillgång till värdefullt mänskligt sensoriskt epitel från inre örat och perilim.
Eftersom VSs härrör från en perifer sensorisk nerv ( dvs vestibulärnerven) är det viktigt att jämföra VS-associerade observationer med de som härrör från en lämplig kontrollnerv, såsom den mänskliga stora aurikulärnerven (GAN). Friska GANs avlivas regelbundet under parotidektomi eller nackdisektioner och kan användas som robusta modeller för hälsosam Schwann cellfysiologi 9 .
Eftersom det inte finns några FDA-godkända läkemedel för behandling eller förebyggande av sporadisk VS, är det absolut nödvändigt att forskare belyser den underliggande molekylära mechaSjukdomar av sjukdomen för att identifiera terapeutiska mål. Proteiner som har visats spela en roll i VS-patogenes innefattar merlin, vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), cyklooxygenas 2 (COX-2), kärnfaktor kappa B (NF-KB), tumörnekrosfaktor alfa (TNF-alfa) Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) och besläktade signalmolekyler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Nya framsteg har utvidgats och förbättrat protokoll för insamling, bearbetning, kultur och efterföljande undersökning av primära humana vestibulära schwannomer och friska nervvävnader 18 , 19 . Men de flesta befintliga protokoll är utformade för att tillgodose förberedelsenVävnad för sådana vävnader för en enda nedströms forskningsapplikation ( dvs. cellkultur ensam). Denna artikel presenterar ett enhetligt metodiskt ramverk för samtidig bearbetning av ett enskilt primärt humant VS- eller GAN-prov för flera nedströmsapplikationer: celltypsspecifik kultur, proteinutvinning, RNA-bevarande, insamling av tumörsecretion och vävnadsfixering. Detta arbete beskriver också kirurgisk insamling och behandling av human cerebrospinalvätska (CSF) och perilimf under translabyrint VS-resektion, eftersom dessa närbesläktade vävnader kan fungera som viktiga källor till biomarkörer för VS. Slutligen presenterar detta protokoll steg för viraltransduktion av primära humana VS-celler i odling som en ny applicering av denna vävnad för användning i genterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskriver en enhetlig metodisk ram för VS-forskning, som beskriver samtidig behandling av humana VS- och GAN-prover för nedströms forskningsapplikationer. Eftersom VS-forskning går in i precisionsmedicinens ålder, kan det vara möjligt att upptäcka molekylära, cellulära, genetiska och proteomiska insikter som är specifika för enskilda patienter för att förbereda samma prov i former som kan svara på många forskningsfrågor.
Renheten hos humana Schwann-celler och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Deafness och andra kommunikationsstörningar som ger R01DC015824 (KMS) och T32DC00038 (stödja JES och SD), försvarsministeriet W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauder Tinnitus Research Center (KMS) och Barnes Foundation (KMS).
Materials
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 ml Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 ml tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 ml | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml), 100 ml | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 ml | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0ml Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 ml | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 ml | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline – 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 ml | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 ml, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 ml | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 ml | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma?. Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma?. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
