Live-cel meting van Odorant Receptor activering met behulp van een Real-time cAMP Assay
Summary
Karakterisering van de functie van odorant receptoren serveert een onmisbaar onderdeel in het proces van deorphanization. Beschrijven we een methode voor het meten van de activering van odorant receptoren in real time via een kamp assay.
Abstract
De enorme grootte van de zoogdieren odorant receptor (OR) families moeilijkheden te vinden hun cognaat liganden onder talrijke vluchtige stoffen opleveren. Om efficiënt en accuraat deorphanize ORs, combineren we het gebruik van een heteroloog cellijn uitspreken zoogdieren ORs en een plasmide genetisch gemodificeerde biosensor voor het meten van cAMP productie stroomafwaarts van de activering van de OR in real-time. Deze test kan worden gebruikt om scherm odorant tegen ORs en vice versa. Positieve odorant-receptor interacties van de schermen kunnen vervolgens worden bevestigd door testen tegen verschillende concentraties van de geur, het genereren van concentratieresponskrommen. Hier wordt deze methode gebruikt voor het uitvoeren van een high-throughput screening van een geurige samengestelde tegen een menselijke OR bibliotheek uitgedrukt in Hana3A cellen en bevestigd dat de receptor positief reageert de cognaat receptor voor de verbinding van belang. Wij vonden dit high-throughput detectiemethode efficiënt en betrouwbaar bij de beoordeling van de activering van de OR en onze gegevens geven een voorbeeld van het mogelijke gebruik ervan in OR functionele studies.
Introduction
De betekenis van geur speelt een belangrijke rol in dieren overleven als ze op hun olfactorische capaciteiten vertrouwen te verkrijgen van voedsel, vermijden van roofdieren en gevaar onderscheiden soorten en selecteer partner1,2. De realisatie van deze functies is afhankelijk van de odorant receptoren (ORs), die individueel worden uitgedrukt aan de Ciliaire oppervlakte van olfactorische sensorische neuronen (OSNs) gelegen in de olfactorische epitheel (OE). ORs vormen de grootste familie van de superfamilie G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) met ongeveer 400 en 1200 verschillende OR genen in mens en muis, respectievelijk3,4,5. ORs geactiveerd door odorant leiden tot verhoogde intracellulaire cAMP niveaus via de sequentiële activering van olfactorische G-eiwit (Golf) en type III adenylyl cyclase (ACIII). Het resulterende verhoogde niveau van intracellulaire cAMP kon functioneren als een tweede boodschapper, die de nucleotide-gated kanaal op het celoppervlak opent, triggering toestroom van kationen met inbegrip van Ca2 + en actie potentieel, en uiteindelijk initiëren Neuro-potentieel transmissie en de olfactorische waarneming. Het proces voor het opsporen en discrimineren van een groot aantal reukstoffen door ORs wordt beschouwd als de eerste stap van olfactorische waarneming6,7.
Aangezien Buck en Axel8 eerst succesvol gekloond odorant receptoren en het mechanisme van de olfactorische waarneming geïnitieerd door ORs opgehelderd, werd deorphanization van de OR-familie één van de hotspots op dit gebied. Verschillende in vivo, ex vivo en in vitro methoden voor het meten van de activering van de OR zijn gerapporteerde9,10,11,12. Een traditionele methode die gebruikt Ca2 + imaging gevolgd door eencellige RT-PCR op OSNs ingeschakeld de identificatie van verschillende ORs tot en met alifatische odorant13,14,15. Meer recentelijk, de komst van grootschalige transcriptome analyses bevorderd de ontwikkeling van meer high-throughput in vivo methoden. De Kentucky assay geïdentificeerd eugenol – en Muskon-responsieve muis ORs met het gebruik van de S100a5-tauGFP verslaggever muis stam en microarray analyse9. Op basis van de afname van de OR mRNA niveaus na odorant blootstelling, de droom-technologie gebruikt een transcriptomic aanpak om OR activering profielen in beide soorten gewervelde en niet-gewervelde16. Ook, gezien de fosforylatie van S6 in neuronale activeringen, de Matsunami groep gesequenceerd mRNAs van gefosforyleerd ribosoom immunoprecipitations te identificeren responsieve ORs12. Tot slot de Feinstein groep gerapporteerd super sniffer muizen die als een platform om te studeren geur codering in vivo dienen kunnen, bekend als de MouSensor technologie17.
In de in vitro rijk maakt de uitdaging van het kweken van OSNs een heteroloog expressie systeem dat OR functionele expressie in vivo bootst een ideale oplossing voor het uitvoeren van grootschalig onderzoek van geurige chemicaliën voor ultraperifere regio’s. Niettemin, aangezien gekweekte cellijnen van niet-olfactorische oorsprong van inheemse OSNs verschillen, of eiwitten in het endoplasmatisch reticulum en kunnen verkeer naar het plasmamembraan zijn behouden, resulterend in OR afbraak en verlies van receptor functie18 , 19. om dit probleem oplossen, uitgebreide werken zijn aangebracht om te repliceren de functionele expressie OR op de celmembraan in heterologe cellijnen. Krautwurst et al. eerst de eerste 20 aminozuren van rodopsine (Rho-tag) gekoppeld aan de N-terminal OR eiwit en dit bevorderd de celoppervlak expressie van sommige ultraperifere regio’s in menselijke embryonale nier (HEK) cellen20. Door het uitvoeren van een seriële analyse van gen expressie (SALIE) bibliotheek analyse van één OSNs, Saito et al. eerst gekloond receptor-transport eiwit (RTP) familieleden, RTP1 en RTP2 en de receptor expressie enhancer eiwit 1 (REEP1), dat vergemakkelijkt OR mensenhandel aan de celmembraan en verbeterde odorant-gemedieerde reacties van ultraperifere regio’s in de cellen van de HEK293T 21. op basis van deze bevindingen, de Matsunami-Fractie gebracht de cellijn van Hana3A, stabiel transfected met RTP1, RTP2, REEP1 en Gαolf in HEK293T en Transient transfected met Rho-gelabeld ORs, voor efficiënte of functionele expressie. Latere studies bleek 1) een korter vorm van RTP1, RTP1S, die meer krachtig kunnen bevorderen of functioneren dan de oorspronkelijke RTP1 eiwitten en 2) het type 3 muscarinerge acetylcholine receptor (M3R) die, OR activiteiten via remming van β-arrestin-2 verhogen kan werving, die beide met het heterologe expressie systeem kennisgemaakt voor het optimaliseren van experimentele output22,23.
Verschillende detectiemethoden zijn gebruikt om het kwantificeren van receptor activering in heterologe systemen. De assay secreted placenta alkalisch fosfatase (SEAP) werkt met een verslaggever enzym transcriptionally geregeld cAMP response-elementen (CREs), waardoor het een aantrekkelijke optie zijn voor de beoordeling van de activering van de OR. De fluorescentie wordt het gemakkelijk ontdekt in een monster van het kweekmedium na de incubatie met SEAP detectie reagens24. Met behulp van deze methode, de functies van de ultraperifere regio’s, alsmede een tweede klasse aanwezig receptoren uitgedrukt in de OE-de trace amine-geassocieerde receptoren (TAARs) zijn gekenmerkt25,26,27. Een andere gemeenschappelijke methode, de luciferase assay, gebruikt een firefly luciferase verslaggever gen onder de controle van de cAMP respons-element (CRE). Meten van luminescentie gegenereerd door luciferase productie biedt een efficiënte en robuuste middel OR activering10,11,28te kwantificeren.
Real-time cAMP testen hebben ook wijd gebruikt in dynamisch toezicht op de functie van heterologe of endogene GPCRs. Een voorbeeld van deze geavanceerde gehaltebepalingen maakt gebruik van een genetisch gecodeerde biosensor variant, die beschikt over een cAMP-bindend domein gesmolten tot een gemuteerde vorm van luciferase. Wanneer kamp bindt, leidt de conformationele verandering tot het activeren van luciferase, luminescentie waaruit vervolgens kan worden gemeten met een chemiluminescentie lezer29,30. De real-time cAMP technologie is geschikt voor de-orphaning van menselijke odorant receptoren in de cellen van de HEK293 en NxG 108CC15 gemeldAss = “xref” > 31,32,33, zoals alsook in de Hana3A HEK293T-afgeleide cellen34,35. De Krautwurst-groep ook beschreven in detail de cAMP technologie in real time te geschikt voor grootschalige of screening benaderingen van de bi-directionele32,33.
Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de activering van de OR met behulp van een real-time cAMP assay in Hana3A cellen. In dit protocol wordt de luminescentie van levende cellen vooraf zijn geëquilibreerd kinetisch gemeten gedurende 30 minuten na de behandeling met specifieke vluchtige stoffen, die een meer efficiënte en nauwkeurige analyse van de activering van de OR die zijn minder gevoelig voor artefacten die zich in de cellulaire omgeving met langdurig en geur-geïnduceerde cel toxicities voordoen. Deze real-time meting voorziet in een grootschalig onderzoek van zowel de ultraperifere regio’s en de liganden, evenals karakterisering van bepaalde OR-ligand paren van belang. Met behulp van deze methode, wij met succes genoemd OR5AN1 de receptor voor de muskus samengestelde Muskon door het uitvoeren van een screening tegen 379 menselijke ORs en vervolgens bevestigt het resultaat positieve screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nauwkeurig meten van een OR activering bij blootstelling aan een bepaalde odorant is de eerste stap in het ontcijferen van de codering van de olfactorische informatie. De experimenten aangetoond in deze studie vertegenwoordigen die een voorbeeld van hoe men identificeren kan, met behulp van een in vitro OR expressie systeem, responsieve ORs onder de menselijke OR repertoire voor de geurige chemische stof van belang en vervolgens het karakteriseren van de receptor farmacologie met behulp van verschillende concent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door het Chinese National Science Foundation (31070972), de wetenschap en de technologie Commissie van Shanghai gemeente (16ZR1418300), het programma voor innovatieve onderzoek Team van Shanghai gemeentelijk onderwijs Commissie, de oostelijke Shanghai Geleerde programma (J50201), en het programma van de nationale fundamenteel onderzoek van China (2012CB910401).
Materials
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, w/o calcium chloride and magnesium chloride | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, w/EBSS and w/L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, w/o calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, w/ 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D. Following the scent of avian olfaction. Science. 286 (5440), 704-705 (1999).
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D’Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al. Implausibility of the vibrational theory of olfaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), E2766-E2774 (2015).
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
