Summary
وصف وظيفة مستقبلات الرائحة يخدم جزءا لا غنى عنه في عملية ديورفانيزيشن. يصف لنا طريقة لقياس تنشيط مستقبلات الرائحة في الوقت الحقيقي باستخدام مقايسة مخيم.
Abstract
أحجام ضخمة من الأسر (أو) مستقبلات الرائحة الثدييات صعوبات للعثور على يغاندس المشابهة بين العديد من المواد الكيميائية المتطايرة. بكفاءة ودقة ديورفانيزي أملاح الإماهة الفموية، ونحن الجمع بين استخدام خط الخلية مغايرة للتعبير عن الثدييات أملاح الإماهة الفموية وبلازميد biosensor معدلة وراثيا لقياس إنتاج المخيم المصب أو التنشيط في الوقت الحقيقي. يمكن استخدام هذا التحليل للشاشة odorants ضد أملاح الإماهة الفموية، و العكس بالعكس. يمكن تأكيد التفاعلات مستقبلات الرائحة من على شاشات في وقت لاحق عن طريق اختبار ضد مختلف رائحة تركيزات، توليد منحنيات التركيز-استجابة إيجابية. هنا استخدمنا هذا الأسلوب لإجراء فرز الفائق مجمع معطر ضد بشرية أو مكتبة المعرب عنها في الخلايا Hana3A وأكدت أن مستقبلات ردا إيجابيا من مستقبلات المشابهة لمجمع الفائدة. وجدنا هذا الأسلوب الكشف عن الفائق لتكون فعالة وموثوق بها في تقييم أو التنشيط وتقديم البيانات المتوفرة لدينا مثال على إمكانية استخدامها في الدراسات الفنية أو.
Introduction
حاسة الشم دوراً هاما في بقاء الحيوانات كما أنهم يعتمدون على قدراتهم حاسة الشم للحصول على الغذاء وتجنب الحيوانات المفترسة وخطر، والتمييز بين الأنواع وحدد ماتي1،2. ويتوقف تحقيق هذه المهام على مستقبلات الرائحة (أملاح الإماهة الفموية)، التي يتم التعبير عنها على حدة على السطح الهدبية الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (أوسنس) الواقعة في ظهارة حاسة الشم (عمر الفاروق). أملاح الإماهة الفموية تشكل أكبر عائلة من فوق مستقبلات (GPCR) ز-البروتين إلى جانب عائلة مع حوالي 400 و 1200 الجينات أو متنوعة في الإنسان والفأر، على التوالي3،4،5. تؤدي إلى زيادة مستويات المخيمات داخل الخلايا عن طريق تنشيط حاسة الشم ز-البروتين (زجبهة تحرير أورومو) متسلسلة أملاح الإماهة الفموية تفعيلها من خلال أودورانتس واكتب الثالث adenylyl cyclase (أسييي). زيادة مستوى الناتج من مخيم داخل الخلايا يمكن أن تعمل كثاني رسول، الذي يفتح بوابات النوكليوتيدات القناة على سطح الخلية، أدى تدفق الاتصالات بما في ذلك Ca2 + وإمكانات العمل، والشروع في نهاية المطاف الإرسال العصبية ذات الإمكانات وتصور حاسة الشم. ويعتبر عملية كشف وتمييز عدد كبير من أودورانتس من أملاح الإماهة الفموية كخطوة أولى لتصور حاسة الشم6،7.
منذ أكسل وباك8 أولاً بنجاح استنساخ مستقبلات الرائحة وتوضيح الآلية التي تصور حاسة الشم التي بدأتها أملاح الإماهة الفموية، ديورفانيزيشن الأسرة أو أصبحت واحدة من النقاط الفعالة في هذا المجال. وكانت أساليب مختلفة في فيفو فيفو السابقين و في المختبر لقياس التنشيط أو المبلغ عنها9،10،،من1112. طريقة تقليدية التي تستخدم Ca2 + تصوير تليها RT-PCR خلية واحدة في أوسنس تمكين تحديد مختلف أملاح الإماهة الفموية إلى odorants الاليفاتيه13،،من1415. في الآونة الأخيرة، ظهور تحليلات واسعة النطاق الترنسكربيتوم تشجع على تطوير أساليب أكثر الفائق في فيفو . وحددت المقايسة كنتاكي الماوس استجابة الاوجينول ومسكون أملاح الإماهة الفموية باستخدام S100a5-تاوجفب مراسل الماوس ميكرواري والإجهاد تحليل9. استناداً إلى انخفاض مستويات مرناً أو بعد التعرض الرائحة، توظيف التكنولوجيا حلم نهج ترانسكريبتوميك لتحديد ملامح التنشيط أو في كلا الأنواع الفقارية وغير فقاريات16. وبالمثل، ونظرا الفسفرة S6 في تفعيل الخلايا العصبية، ماتسونامي المجموعة مرناس متسلسلة من الريبوسوم فوسفوريلاتيد إيمونوبريسيبيتيشنز لتحديد استجابة أملاح الإماهة الفموية12. وأخيراً، أفاد فريق اينشتاين الشم سوبر الفئران التي يمكن أن تخدم كمنصة لدراسة رائحة الترميز في فيفو، المعروفة باسم التكنولوجيا موسينسور17.
في عالم في المختبر ، يجعل التحدي المتمثل في استزراع أوسنس تعبير مغايرة نظام يحاكي أو التعبير الوظيفي في فيفو حلاً مثاليا لإجراء الفرز على نطاق واسع من المواد الكيميائية معطر لأملاح الإماهة الفموية. على الرغم من ذلك، نظراً لخطوط الخلايا المستزرعة من أصول غير حاسة الشم تختلف عن أوسنس الأصلي، أو يتم الاحتفاظ بالبروتينات في هيولى وغير قادر على الحركة إلى غشاء البلازما، مما أدى إلى تدهور أو وفقدان وظيفة مستقبلات18 , 19-قد بذلت لحل هذه المشكلة، يعمل واسعة النطاق لتكرار التعبير الوظيفي أو على غشاء الخلية في خطوط الخلايا مغايرة. كراوتوورست et al. أولاً يعلق الأحماض الأمينية أول 20 من رهودوبسن (رو--علامة) إلى N--المحطة الطرفية أو البروتين وهذا تشجيع التعبير سطح الخلية لبعض أملاح الإماهة الفموية في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)20. بإجراء تحليل الجينات التعبير (سيج) مكتبة التحليل من أوسنس واحدة، لمسلسل سايتو وآخرون. أولاً استنساخ أفراد الأسرة تنقل مستقبلات البروتين (RTP) RTP1 و RTP2 والتعبير مستقبلات البروتين محسن 1 (REEP1) التي سهلت أو الاتجار بغشاء الخلية وتعزيز الاستجابات الرائحة بوساطة من أملاح الإماهة الفموية في الخلايا HEK293T 21. وبناء على هذه النتائج، ماتسونامي مجموعة نجحت في إنشاء خط الخلية Hana3A، ستابلي transfected مع RTP1، RTP2، REEP1، و Gαجبهة تحرير أورومو في HEK293T، وعابر transfected مع أملاح الإماهة الفموية معلم رو، لكفاءة أو الوظيفية التعبير. اللاحقة كشفت الدراسات 1) نموذج أقصر من RTP1، RTP1S، التي يمكن أن تعزز أكثر قوة أو تعمل من البروتين RTP1 الأصلي و 2) مستقبلات أستيل المسكارينيه النوع 3 (M3R) التي يمكن أن تعزز النشاط أو عن طريق تثبيط β-أرريستين-2 التوظيف، التي أدخلت إلى نظام تعبير مغايرة لتحسين التجريبية إخراج22،23.
وقد استخدمت عدة أساليب الكشف التحديد الكمي لتنشيط مستقبلات في أنظمة مغايرة. يعمل الإنزيم يفرز الفوسفاتيز القلوية المشيمية (السكرتارية) مع مراسل إنزيم ترانسكريبتيونالي وينظم المخيم استجابة العناصر (كريس)، يجعلها خياراً جذاباً لتقييم أو التنشيط. يتم الكشف عن الأسفار سهولة في عينة من المتوسط الثقافة بعد الحضانة مع السكرتارية الكشف عن الكاشف24. باستخدام هذا الأسلوب، تتسم المهام لأملاح الإماهة الفموية، فضلا عن فئة ثانوية من مستقبلات تشيموسينسوري في تتبع عمر الفاروق، كانت المستقبلات المرتبطة بأمين (تارس) وأعرب عن25،،من2627. يستخدم أسلوب مشترك آخر، الإنزيم لوسيفراس، جينات مراسل لوسيفراس اليراع تحت سيطرة عنصر الاستجابة المخيم (CRE). قياس التﻷلؤ المتولدة عن إنتاج لوسيفراس يوفر وسيلة فعالة وقوية للتحديد الكمي أو التنشيط10،،من1128.
فحوصات المخيم في الوقت الحقيقي كما تستخدم على نطاق واسع في رصد وظيفة جبكرس مغايرة أو الذاتية بشكل حيوي. مثال واحد من هذه فحوصات متقدمة يستفيد من متغير بيوسينسور المشفرة جينياً، التي تمتلك مجال ملزم مخيم تنصهر بشكل المسخ من لوسيفراس. عندما تربط المخيم، يؤدي تغيير كونفورماشونال لتنشيط لوسيفراس، التﻷلؤ من الذي يمكن أن يقاس ثم مع29،تشيميلومينيسسينسي قارئ30. ذكر مناسبة تيتم الرفع من مستقبلات الرائحة البشرية في الخلايا 108CC15 HEK293 ونكسج التكنولوجيا المخيم في الوقت الحقيقيالحمار = "xref" > 31،،من3233، كما جيدا كما هو الحال في Hana3A المستمدة من HEK293T الخلايا34،35. كما وصف الفريق كراوتوورست بالتفصيل التكنولوجيا المخيم في الوقت الحقيقي لتكون مناسبة للنهج على نطاق واسع أو الفحص ثنائي32،33.
هنا يمكننا وصف بروتوكول لقياس التنشيط أو استخدام مقايسة مخيم في الوقت الحقيقي في الخلايا Hana3A. في هذا البروتوكول، يقاس التﻷلؤ خلايا حية قبل متوازن كينيتيكالي لمدة 30 دقيقة عقب العلاج بالمركبات المتطايرة محددة، ويمثل إجراء تحليل أكثر كفاءة ودقة للتنشيط أو التي أقل عرضه القطع الأثرية التي تحدث في البيئة الخلوية مع الوقت الطويل والسمية الناجمة عن رائحة الخلية. يسمح هذا القياس في الوقت الحقيقي لغربلة واسعة النطاق من أملاح الإماهة الفموية ويغاندس على حد سواء، فضلا عن توصيف أزواج أو يجند معينة من الفائدة. باستخدام هذا الأسلوب، بنجاح حددنا OR5AN1 المستقبلات مسكون مجمع المسك قبل إجراء فحص ضد 379 من أملاح الإماهة الفموية البشرية ويؤكد فيما بعد نتيجة الفحص إيجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-كولتورينج وصيانة الخلايا Hana3A
- المحافظة على الخلايا في 10 مل متوسطة الأساسية الدنيا (MEM) مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين، و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب في 100 ملم خلية ثقافة طبق في حاضنة ثقافة خلية 37 درجة مئوية مع 5% CO 2. مع كل مرور أخرى، أضف 1 ميكروغرام/مل بوروميسين للحفاظ على تعداء مستقرة من البلازميدات (انظر المقدمة).
ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على زراعة الخلايا في الصف الثاني السلامة البيولوجية مجلس الوزراء لضمان بيئة معقمة. - ثقافة فرعية بنسبة 10-20% في 100 ملم الأطباق كل 2-3 أيام-
2. طلاء الخلايا تعداء
- مراقبة الخلايا Hana3A تحت مجهر تباين مرحلة لضمان بقاء الخلية وتقدير التقاء.
- نضح المتوسطة كل من طبق ثقافة الخلية.
- غسل الخلايا بإضافة 10 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) على اللوحة ويحوم الطبق يسفط في برنامج تلفزيوني. أضف 3 مل من حمض 0.05% الإثيلين التربسين ديامينى tetraacetic (أدتا) على اللوحة
- . المزيج لمدة 1 دقيقة أو حتى كافة الخلايا طافية.
ملاحظة: مراقبة التقدم المحرز في الخلايا فصل من الجزء السفلي من لوحة تحت المجهر حسب الاقتضاء. - التربسين إيناكتيفاتي بإضافة 5 مل MEM مع 10% FBS وماصة صعودا وهبوطاً لتفريق أجزاء من الخلية ماساشوستس
ملاحظة: للطلاء قبل تعداء، لا ينبغي أن يتضمن المتوسطة استخدام المضادات الحيوية. بالإضافة للمضادات الحيوية قد يقلل من كفاءة تعداء. - نقل مبلغ مناسب من الخلايا إلى أنبوب 15-mLl اعتماداً على عدد اللوحات تكون ترانسفيكتيد. لكل لوحة 96، حسنا، لوحة 2 × 10 6 خلايا، أو حوالي 1/5 من طبق المتلاقية 100 مم 100%، إعطاء عدد خلايا 2 × 10 4 خلايا كل بئر أو بكثافة من حوالي 15-30% التقاء كل بئر. الطرد المركزي أنابيب في 200 غ س لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية دون إزعاج بيليه الخلية.
ملاحظة: حساب المبلغ الصحيح للخلايا تكون مطلية على لوحات 96-جيدا لتجنب أوفيرجرووينج أو أونديرجرووينج الخلايا قبل التحفيز. - إضافة مبلغ مناسب من MEM مع 10% FBS في 15 مل أنبوب و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً لتفريق أجزاء من الخلية الجماعية. لكل لوحة 96، حسنا، ريسوسبيند الخلايا مع 6 مل MEM مع 10% FBS.
ملاحظة: كن حذراً لا لتوليد فقاعات الهواء في الأنبوب.
إضافة - الخلايا مع وقف التنفيذ في المكمن. استخدام ماصة متعددة القنوات، "الماصة؛" 50 ميليلتر من الخلايا على كل بئر من صفيحة 96-جيدا. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
3. تعداء البلازميدات
- قبل تعداء، مراقبة الخلايا مطلي لضمان التقاء سليم حوالي 30-50 في المائة البئر تحت مجهر تباين مرحلة والعودة إلى الحاضنة.
- تحضير مقدما أو معلم رو بناء 11 ، 21 ، ، من 22 28، عامل ملحق بنيات (RTP1S 22 ، 36 و M3R 23)، وبناء البديل بيوسينسور 29 ، 30 من مينيبريب. قياس تركيز الحمض النووي بجهاز المطياف الضوئي وضبط تركيزات الحمض النووي بلازميد (مثلاً، إلى 100 نانوغرام/ميليلتر) مع الماء المقطر عند الاقتضاء.
- إعداد "الخلائط تعداء"
- إعداد خليط تعداء بلازميد في 500 ميليلتر من MEM لكل لوحة 96-جيدا وفقا الجدول 1-
ملاحظة: عندما يتم اختبار أملاح مختلفة على نفس اللوحة 96، حسنا، يجب تكييف حجم الخليط تعداء ومقدار بلازميد الحمض النووي وأضاف في الدالة عدد من الآبار transfected مع أو معين. - تحضير خليط تعداء في أنبوب مع 18 ميليلتر من تعداء الدهن بوساطة كاشف في 500 ميليلتر من MEM.
- إعداد خليط تعداء بلازميد في 500 ميليلتر من MEM لكل لوحة 96-جيدا وفقا الجدول 1-
- مزيج الخليط بلازميد مع خليط تعداء من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان في درجة حرارة الغرفة ل 15 دقيقة
- وقف رد الفعل بإضافة 5 مل MEM مع 10% FBS.
- انتشرت طبقة سميكة من مناشف ورقية معقمة في هود ثقافة الخلية. خذ صفيحة 96-جيدا مع الخلايا من الحاضنة. بلطف ومرارا وتكرارا حنفية لوحة رأسا على كومة منشفة ورقية حيث أن المتوسط يمتص تماما بمنشفة ورقية.
ملاحظة: لا قوة أو فجأة اضغط على اللوحة واحدة يمكن أن نفقد خلايا. - نقل 50 ميليلتر من خليط تعداء المجمعة لكل بئر من لوحة 96-جيدا واحتضان بين عشية وضحاها على ح 18-24 في 37 درجة مئوية مع 5% CO 2-
ملاحظة: جدول تعداء وتحفيز إدارة الوقت ينبغي أن تسبق القياس عند أكثر من 96-جيدا لوحة يتم اختبارها في تجربة واحدة كي يكون جميع لوحات تقاس بعد نفس تعداء الوقت ووقت التعرض التحفيز.
4. التحفيز وقياس أو نشاط "الإنزيم المخيم في الوقت الحقيقي" باستخدام
- مراقبة transfected الخلايا تحت مجهر مرحلة عالي تباين لضمان التقاء سليم من 50-80% لكل بئر والعودة إلى الحاضنة.
- إعداد متوسطة التحفيز بإضافة 10 مم هيدروكسيثيل بيبيرازينيثانيسولفونيك حمض (حبيس) و 5 ملم الجلوكوز إلى هانك ' s حل متوازن الملح (حبس)-
- ذوبان مختبرين كاشف الركازة المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي على الجليد. تخزين كاشف الركيزة في-80 درجة مئوية في ميليلتر 55 كل أنبوب في أنابيب PCR. استخدام أنبوب 1 للوحة الواحدة.
- إعداد الحل الموازنة 2% بخلط ميليلتر 55 من الكاشف الركيزة والحل حبس/حبيس/الجلوكوز ميليلتر 2750.
- انتشرت طبقة سميكة من المناشف الورقية على مقاعد البدلاء. اضغط برفق مرارا وتكرارا لوحة رأسا على منشفة ورقية حيث أن المتوسط تعداء يمتص تماما بمنشفة ورقية.
- تغسل الخلايا من بيبيتينج ميليلتر 50 حبس/حبيس/الجلوكوز إلى حل لكل بئر.
- برفق مرارا وتكرارا الاستفادة من الحل هبس/هيبيس/الجلوكوز من لوحة 96-جيدا-
- ماصة 25 ميليلتر من حل الموازنة 2% لكل منهما جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة في الظلام ل 2 حاء
- إعداد مقدما 1 م الحلول الرائحة الأسهم في [دمس] ومخزن في-20 درجة مئوية إلى حين استخدامها.
- قبل نهاية فترة الحضانة، تخفف الرائحة والحلول الأسهم لتركيزات العامل في هبس/هيبيس/الجلوكوز التحفيز المتوسطة-
ملاحظة: ينبغي مضاعفة تركيزات تخفيف الرائحة التي أعدت في هذا الخطوة تسفر التركيزات النهائية الصحيحة في كل بئر- - تشيميلومينيسسينسي باستخدام لوحة قارئ وقبل إضافة الرائحة، قياس مستوى التﻷلؤ القاعدية لصفيحة 2 مرات متتالية بمعدل 1000 مللي ثانية كل جيدا 34.
- بسرعة إزالة اللوحة من قارئ اللوحة وإضافة تخفيف الرائحة ميليلتر 25 لكل بئر والبدء فورا في قياس التﻷلؤ المستمر لجميع الآبار لدورات 20 ضمن الحد الأدنى 30
ملاحظة: ماصة بعناية لتجنب تلويث المجاورة الآبار عند استخدام أودورانتس مختلفة و/أو تركيزات مختلفة من أودورانتس نفسه في اللوحة نفسها.
5. تحليل بيانات
- تصدير البيانات من برنامج قارئ لوحة تشيميلومينيسسينسي.
- حساب تطبيع أو استجابة لكل مرة استخدام الصيغة
(التﻷلؤ N – التﻷلؤ القاعدية)/(التﻷلؤ أعلى – التﻷلؤ القاعدية)
حيث N = قيمة التﻷلؤ من معين جيدا؛ والقاعدية = التﻷلؤ متوسط قيمة اثنين القاعدية ضيائية القيم؛ أعلى = أعلى قيمة التﻷلؤ للوحة أو مجموعة لوحات.
ملاحظة: اعتماداً على غرض التجربة، يمكن اعتماد تمثيلات رسومية بديلة. على سبيل المثال، لفرز فحوصات (انظر الشكل 1) ومن أجل توليد استجابة تركيز المنحنيات، قيمة التﻷلؤ بئر معينة عند نقطة وقت المطلوب أثناء قياس الحركية، مثل الحد الأقصى للقيمة أو يمكن استخدام القيمة النهائية،.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مسكون هو العنصر الرئيسي العطرية من المسك الطبيعي. الدراسات الأخيرة OR5AN1 التي تم تحديدها كمستقبل بشرية مسكون وغيرها من المركبات المسك ماكروسيكليك استناداً إلى التماثل بالماوس، أو MOR215-1، مستنسخ من glomeruli مسكون المراعية في التصرف الفئران37،38. بفحص مرجع أو البشرية ومجموعتنا ومجموعة تورا أيضا التعرف على OR5AN1 كمستقبل رئيسي لمركبات المسك ماكروسيكليك اثنين وسيكلوبينتاديكانوني ومسكون، على التوالي، استخدام لوسيفراس فحص نظام38،39 .
استخدام المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي هو موضح هنا، ونحن فحص مرجع أو البشرية ضد 30 ميكرومتر مسكون (الشكل 1). بين أملاح البشرية 379 فرزهم، برز OR5AN1 مع استجابة بارزة إلى مسكون، بينما لم تظهر استجابة كبيرة أملاح الإماهة الفموية الأخرى وعناصر سلبية (عنصر التحكم لا رائحة وناقلات فارغة). اختبار عنصر التحكم الإيجابي OR5AN1 ضد 30 ميكرومتر المسك تيبيتيني، يجند ل OR5AN1 (بيانات غير منشورة)، وكان يستخدم لتطبيع استجابة لأملاح الإماهة الفموية إلى مسكون. للحصول على تمثيل رسومي لهذه المجموعة من البيانات، اخترنا النقطة الزمنية عندما تحقق القراءة التﻷلؤ الحد الأقصى ل OR5AN1 ضد 30 ميكرومتر المسك تيبيتيني.
درسنا القادم العلاقة تركيز-استجابة للرائحة-زوج أو بتركيزات مختلفة 3 مسكون. لكل تركيز مسكون اختبارها، خلال أول 20 دقيقة بعد إضافة مسكون، استجابة OR5AN1 زادت تدريجيا وثم استقرت في الماضي 10 دقيقة (الشكل 2A) بينما ظلت تتبع لمراقبة إضافة لا رائحة (0 ميكرومتر مسكون) شقة نسبيا. أعلى تركيزات مسكون أثارت ردود أو أقوى من تلك الدنيا، التي يمكن تمييزها في جميع أنحاء القياس. استخدام النقطة المرة الأخيرة من قياس الحركية، ونحن إنشاء منحنى استجابة لتركيز ويقدر تركيز 50% من القيمة القصوى أثر (المفوضية الأوروبية50) المنحنى 20.82 ميكرومتر (الشكل 2).
الشكل 1: فحص للبشرية أملاح الإماهة الفموية من مسكون.
تم فحص 379 من أملاح الإماهة الفموية بشرية فريدة من نوعها ضد 30 ميكرومتر مسكون باستخدام مقايسة المخيم في الوقت الحقيقي. الملونة كتل على طول x-المحور تشير إلى أسر أو بشرية مختلفة. كل عمود على x-المحور يمثل نوع واحد أو باستثناء الأعمدة الثلاثة الأخيرة، وهي استجابة OR5AN1 30 تيبيتيني المسك ميكرومتر (عنصر تحكم إيجابية)، استجابة OR5AN1 لحل هبس/هيبيس/الجلوكوز (لا رائحة سلبية تحكم)، ورد رو-pCI إلى 30 ميكرومتر مسكون (متجه فارغة سلبية عنصر)، من اليسار إلى اليمين. ذ-يمثل محور التﻷلؤ تم تسويتها في 30 دقيقة بعد إضافة الرائحة عند الرد الذي تم التوصل إليه كحد أقصى لمراقبة إيجابية (N = 3). يتم تطبيع جميع الردود إلى عنصر إيجابي. تمثل أشرطة الخطأ يعني الخطأ القياسي (SEM). للوضوح، تظهر أشرطة الخطأ الإيجابية فقط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: قياسات الحركية لاستجابة OR5AN1 مسكون.
(A) وأجريت قياسات في الوقت الحقيقي من OR5AN1 التنشيط بواسطة مسكون من تركيزات مختلفة وعنصر تحكم سلبية رائحة لا داخل 30 دقيقة من إضافة الرائحة. يشير السهم إلى نقطة وقت إضافة الرائحة. (ب) تركيز-استجابة منحنى OR5AN1 ضد مسكون في 30 دقيقة بعد إضافة الرائحة. ذ-تمثل محاور التﻷلؤ تطبيع (N = 3). يتم تطبيع جميع الردود إلى الاستجابة أعلى إلى 100 ميكرومتر مسكون. أشرطة الخطأ تمثل sem. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| بلازميد | المبلغ لكل لوحة 96-جيدا (ميكروغرام) |
| رو-أو | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0.5 |
| البديل بيوسينسور المخيم | 1 |
الجدول 1: مكونات المخلوط تعداء.
كل مبلغ لوحة 96-جيدا رو-أو، RTP1S، M3R، ووالبلازميدات البديل بيوسينسور المخيم في الوقت الحقيقي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
دقة قياس التنشيط أو عند التعرض للرائحة معينة هو الخطوة الأولى في فك ترميز المعلومات حاسة الشم. أظهرت التجارب في هذه الدراسة تمثل مثالاً لأحد كيف يمكن تحديد، باستخدام في المختبر أو تعبير النظام، استجابة أملاح الإماهة الفموية بين مرجع أو البشرية للمادة الكيميائية معطر للفائدة وتميز في وقت لاحق مستقبلات علم الأدوية باستخدام تركيزات مختلفة من هذه المادة الكيميائية. وتؤكد النتائج التي توصلنا إليها OR5AN1 كمستقبل حسن النية مسكون. وهذا يتسق مع تقرير سابق39 وتوفر المزيد من الأدلة للتكهنات بأن عددا قليلاً فقط من مستقبلات تشارك في الاستشعار عن27،رائحة المسك40. بالمقارنة مع بيانات الفحص من ساتو-أكرا et al. ، التي يتم إنشاؤها بواسطة الإنزيم لوسيفراس على نظام تعبير مشابهة أو مغايرة، أظهرت نتائج الفحص أسوأ قليلاً نسبة الإشارة إلى الضجيج. بالإضافة إلى الاختلافات المتأصلة للتقنيات المختلفة المعنية، يمكن أن يكون الفرق في الإخراج يرجع ذلك إلى حقيقة أن استخدمنا تركيز مسكون أقل (30 ميكرومتر مقابل 100 ميكرومتر). في الواقع، قيمة50 EC منحنى الاستجابة لتركيز OR5AN1 ضد مسكون حصلنا عليها عن طريق المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي في نفس ترتيب الحجم كالذي حصل ساتو-أكرا et al. في نظام الفحص لوسيفراس، إثبات النتائج قابلة للمقارنة لنفس مغايرة أو تعبير النظام حتى عندما تستخدم أساليب الكشف عن مختلف. وفي دراسة أخرى، وجدت مجموعتنا أن النظام المخيم في الوقت الحقيقي قد يكون قليلاً أكثر حساسية من النظام لوسيفراس الجينات مراسل في تقييم الانتقائية مستقبلات OR2T11، نظراً لأن عدد قليل من أودورانتس النشطة فقط في السابق ولكن ليس في الأخير 35من النظام. بالمقارنة مع سلسلة البيانات المبلغ عنها بواسطة غيث et al. 31 في OR1A1 ضد (+)-كارفوني، لدينا بيانات عن OR5AN1 ضد مسكون أظهرت حدوث تأخير في الوقت اللازم للوصول إلى الهضبة التي قد تنجم مباشرة عن أنواع مختلفة من أملاح الإماهة الفموية و odorants المستخدمة. في غيرها المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي البيانات المبلغ عنها من مجموعتنا، كما أظهر أوقات متفاوتة ذروة تبعاً لأملاح الإماهة الفموية وأودورانتس34،35. وبالإضافة إلى ذلك، خطوط الخلايا المختلفة المستخدمة للتعبير عن أملاح الإماهة الفموية، الركيزة المختلفة المستخدمة، والبلازميدات متغير مختلف بيوسينسور المخيم في الوقت الحقيقي، وحساسية مختلفة قارئ لوحة تشيميلومينيسسينسي، و/أو ظروف تجريبية مختلفة، مثل التباين في درجة حرارة الغرفة، ويمكن أن تسهم جميع الاختلافات في إخراج التﻷلؤ.
والرزن المخيم في الوقت الحقيقي يظهر العديد من المزايا عبر طرق أخرى لقياس أو التنشيط. أولاً، مماثل لتحليل الجينات مراسل لوسيفراس، الإنزيم المخيم في الوقت الحقيقي يوفر وسيلة إضافية في المختبر لتحديد الفائق لمبدع أو الرد على أودورانتس. شاشات مستقبلات و/أو الرائحة على نطاق واسع بمقايسة المخيم في الوقت الحقيقي يمكن أن توفر كمية كبيرة من المعلومات عن مستقبلات-رائحة الاقتران مع استخدام عدد قليل من لوحات. عندما متقدمة تتوفر لومينوميتيرس والروبوتات بيبيتينج والبروتوكول 96-جيدا الموصوفة هنا يمكن ترقيتها بسهولة إلى تنسيق 384، حسنا، في أي حتى أقل بلازميد الحمض النووي والكواشف اللازمة لكل وحدة مخرجات البيانات. ثانيا، الأسلوب المخيم في الوقت الحقيقي قادر على قياس التغيرات في تركيز داخل الخلايا من المخيم في الوقت الحقيقي. بينما معظم الاختبارات المستخدمة لقياس النشاط أو إلى تاريخ الأسفار أو تشيميلومينيسسينسي-على أساس نقطة النهاية الكشف التي تتطلب خلية تفسخ، المخيم في الوقت الحقيقي الاعتداء إيسيمبليمينتيد تحت ظروف غير الحال، خلية يعيش أكثر مشابهة لذاتية الوضع، وأن تمكن من رصد التغيرات في مستويات المخيم. وثالثاً، وقت أقصر نسبيا المطلوبة لتنفيذ الأسلوب في الوقت الحقيقي. أسلوب التحليل الفائق آخر أو وظيفة، والذي يعتمد على تعبير جينات مراسل لوسيفراس، يحتاج ح 4 إضافية بعد تنشيط رائحة لإكمال تجربة. وفي بعض الحالات، قد يؤدي فترة حضانة طويلة رائحة السمية الرائحة المحتملة للخلايا، والذي هو التخفيف من فعالية تحت التعرض عابرة. وبالإضافة إلى ذلك، في تجارب أطول أمداً، زادت فرص تلوث الآبار المجاورة بالتطاير عند استخدام أودورانتس مختلفة و/أو تركيزات مختلفة من الرائحة نفسها في نفس اللوحة هي أيضا. الكشف فورا بعد إضافة رائحة يجعل المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي نموذج سريعة وموثوق بها.
الاعتداء القيود المفروضة على المخيم في الوقت الحقيقي لقياس أو التنشيط كما يلي. أولاً، لدينا في المختبر التحليل يستند إلى خط خلية المستمدة من HEK293T التي تفتقر إلى العديد من الجزيئات الذاتية الأصلية من الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم. وعلاوة على ذلك، الانزيمية التحويلات التي تحدث في المخاط الأنفي والبروتينات القابلة للذوبان قد ربط مع أودورانتس أو التأثير التقارب أو ل odorants. ولذلك، قد تختلف التنشيط في نظام مغايرة عن الحالة في فيفو من حيث الحساسية وضبط رائحة. ثانيا، يتطلب تحديد أملاح الإماهة الفموية للرائحة معين مرجع أو أسرة من نوع معين على الأقل. أملاح الإماهة الفموية هي عائلة كبيرة من جبكرس والعدد من البروتينات أو في الإنسان والفأر كبير جداً4،5،41. قدرا كبيرا من الوقت والجهد قد تكون ضالعة في استنساخ كل مرجع أو الفائدة. ثالثا، على الرغم من أن يشمل نظام تعبير مغايرة أو التعديلات أو تسلسل (مثل علامة رو) وبعض البروتينات الرئيسية أو التبعية (مثل RTP1S و M3R)، نشك في أن ليست جميع أملاح الإماهة الفموية يتم التعبير عن وظيفيا في غشاء الخلية الخلايا المستمدة من HEK293T. ولذلك، نظراً لغياب الردود إلى بعض الرائحة، في المختبر لا يمنع بالضرورة أو استجابة في فيفو، نتيجة لحقيقة أن بعض أملاح الإماهة الفموية قد يكون مجرد المعرب عنها على سطح الخلية ضعيف وغير قادر على التعرف على يغاندس. وهكذا، كلما المخيم في الوقت الحقيقي المحتملة ينبغي استخدام بالاقتران مع غيرها من فحوصات في المختبر و في فيفو للحصول على نتائج أكثر إقناعاً.
العديد من الخطوات الحاسمة ينبغي إيلاء اهتمام إضافي خلال المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي. أولاً، هو درجة الحرارة للتجارب التي تشمل التﻷلؤ عموما، عاملاً رئيسيا يؤثر على نتيجة للتجربة كما الزيادات في درجات الحرارة انخفاض المستويات القاعدية والمتعمد من ناتج الضوء وانخفاض في درجة الحرارة زيادة ناتج الضوء. ولذلك، قبل اكويليبراتينج اللوحات لدرجة حرارة التشغيل حالة ثابتة إينستروميnt قبل إضافة الرائحة ضروري لتجنب تأثير على النتائج الناجمة عن التغيرات في درجات الحرارة. ثانيا، ينبغي أن تعدل تركيزات الكاشف الركازة المقايسة المخيم في الوقت الحقيقي وفقا للحالة الفعلية. عندما يفشل التﻷلؤ القاعدية للوصول إلى أدنى عتبة الكشف للقارئ لوحة تشيميلومينيسسينسي، أحد أن تنظر في زيادة تركيزات الركيزة زيادة الإشارات. وأخيراً، على الرغم من كونها خط خلية ملتصقة، قد فصل الخلايا Hana3A أثناء التجربة. عندما يسفط أو إضافة المتوسطة، وضع نصائح ماصة بجانب البئر يمكن التقليل من اضطراب أحادي الطبقة الخلية. من المهم أيضا أن لوحة الخلايا في بكثافة مناسبة وموحدة لتجنب أوفيرجرووينج الخلايا كبقع كثيفة من الخلايا تميل إلى تقشر أثناء تغيير المتوسطة.
بالإضافة إلى تحديد OR(s) للرائحة اهتمام، مقايسة المخيم في الوقت الحقيقي يمكن أن تستخدم أيضا للشاشة يغاندس المشابهة لمعين أو عندما تتوفر المكتبات للمواد الكيميائية. أخيرا، عندما يتم استخدام أنواع الخلية المناسبة والظروف تعداء، قد تسمح للكشف عن تفعيل هذه العملية أوفيريكسبريسيد أو الذاتية المقايسة أيضا وتعطي منحنيات الاستجابة تعتمد على تركيز ليضع والخصوم على حد سواء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكان دعم العمل "مؤسسة العلوم الوطنية الصينية" (31070972)، والعلوم و "التكنولوجيا لجنة من بلدية شانغهاي" (16ZR1418300)، برنامج "مبتكر البحث فريق من شانغهاي البلدية لجنة التعليم"، شرق شانغهاي الباحث (J50201)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية للصين (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D.
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al.
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
