Summary
Charakterisierung der Funktion der Geruchsstoff Rezeptoren dient einen unverzichtbaren Bestandteil in der Deorphanization-Prozess. Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Aktivierung des Duftstoff-Rezeptoren in Echtzeit über einen cAMP-Assay.
Abstract
Die enorme Größe der Säugetier-Geruchsstoff Rezeptor (OR) Familien Schwierigkeiten, ihre Verwandten Liganden unter zahlreichen flüchtigen Chemikalien zu finden. Um effizient und präzise ORs deorphanize, kombinieren wir die Verwendung einer heterologen Zelllinie Säugetier-ORs und ein genetisch veränderter Biosensor-Plasmid Lager Produktion flussabwärts von OR Aktivierung in Echtzeit zu messen zum Ausdruck bringen. Dieser Test kann auf Bildschirm Geruchsstoffe gegen ORs und umgekehrtverwendet werden. Duftstoff-Rezeptor-positiven Interaktionen von den Bildschirmen können anschließend durch Tests mit verschiedenen Konzentrationen von Geruch, Generierung von Konzentration-Wirkungs-Kurven bestätigt werden. Hier haben wir diese Methode durchführen eine Hochdurchsatz-Screening eine duftende Substanz gegen eine menschliche OR-Bibliothek in Hana3A Zellen exprimiert und bestätigt, dass der Rezeptor reagiert positiv cognate Rezeptor für die Verbindung von Interesse ist. Wir fanden diese Hochdurchsatz-Erkennungsmethode effizient und zuverlässig bei der Beurteilung der OR-Aktivierung und unsere Daten liefern ein Beispiel für den möglichen Einsatz in OR funktionelle Studien.
Introduction
Der Geruchssinn spielt eine wichtige Rolle in der Tiere überleben, da sie verlassen sich auf ihre olfaktorischen Fähigkeiten erhalten Nahrung, Raubtiere und Gefahr zu vermeiden, Arten zu unterscheiden, und wählen Mate1,2. Die Realisierung dieser Funktionen hängt von der Duftstoff-Rezeptoren (ORs), die individuell an die ciliary Oberfläche des olfaktorischen sensorischen Neuronen (Korrelationsmöglichkeiten) befindet sich in der olfaktorischen Epithel (OE) ausgedrückt werden. Regionen in äußerster Randlage bilden die größte Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR)-Superfamilie mit ungefähr 400 und 1200 verschiedene OR Gene im menschlichen und Maus, bzw.3,4,5. Regionen in äußerster Randlage aktiviert durch Geruchsstoffe führen zu erhöhten intrazellulären cAMP-Spiegel über die sequentielle Aktivierung des olfaktorischen G-Protein (GOlf) und Typ III Adenylyl Cyclase (ACIII). Die daraus resultierende erhöhte intrazelluläre cAMP könnte funktionieren als zweiter Bote, der Nucleotide-gated Kanal auf der Zelloberfläche öffnet, Auslösung Zustrom von kationen einschließlich Ca2 + und Aktionspotentiale, und letztlich zu initiieren Neuro-Potenzial Übertragungs- und olfaktorischen Wahrnehmung. Der Prozess der Erkennung und Unterscheidung eine große Anzahl von Riechstoffen von Regionen in äußerster Randlage gilt als der erste Schritt der olfaktorischen Wahrnehmung6,7.
Da Buck und Axel8 zuerst erfolgreich Geruchsstoff Rezeptoren geklont und den Mechanismus der olfaktorischen Wahrnehmung von Regionen in äußerster Randlage initiiert erläutert, wurde Deorphanization der OR-Familie einer der Hotspots in diesem Bereich. Verschiedenen in Vivo, Ex Vivo und in Vitro Methoden, OR Aktivierung zu messen gewesen gemeldeten9,10,11,12. Eine traditionelle Methode, Ca2 + Bildgebung von einzelligen RT-PCR auf Korrelationsmöglichkeiten gefolgt ermöglicht die Identifizierung der verschiedenen Regionen in äußerster Randlage aliphatischen Geruchsstoffe13,14,15. In jüngerer Zeit, das Aufkommen der großen Transkriptom-Analysen förderte die Entwicklung des mehr Hochdurchsatz- in-Vivo -Methoden. Der Kentucky-Test identifiziert Eugenol und Muscone-reagierende Maus ORs mit dem Einsatz der S100a5-TauGFP-Reporter Maus Belastung und Microarray Analyse9. Basierend auf den Rückgang der OR-mRNA-Niveaus nach Geruchsstoff Exposition, beschäftigt die Traum-Technologie ein transkriptomischen Konzept zur Bestimmung des OR Aktivierung Profile in beide Wirbeltiere und nicht-Wirbeltier-Arten-16. In ähnlicher Weise angesichts der Phosphorylierung des S6 in neuronalen Aktivierungen, die Matsunami Gruppe sequenzierten mRNAs aus phosphorylierten Ribosom Immunperoxidase, reaktionsschnelle ORs12zu identifizieren. Schließlich berichtet Feinstein Gruppe super Sniffer-Mäuse, die als Plattform, um Geruch Codierung in Vivo, bekannt als die MouSensor-Technologie-17Studie dienen könnten.
Im Bereich in-vitro- macht die Herausforderung der Kultivierung Korrelationsmöglichkeiten heterologen Expressionssystem, die imitiert, OR funktionelle Expression in Vivo eine ideale Lösung für große Screening von wohlriechenden Chemikalien für Regionen in äußerster Randlage führen. Jedoch da kultivierten Zelllinien nicht olfaktorische Herkunft unterscheiden sich von einheimischen Korrelationsmöglichkeiten oder Proteine werden in dem endoplasmatischen Retikulum und nicht in der Lage, um die Plasmamembran Verkehr beibehalten, was in OR Abbau und Verlust von Rezeptor-Funktion18 , 19. um dieses Problem zu lösen, umfangreiche Werke vorgenommen wurden, OR funktionelle Expression auf der Zellmembran in heterologen Zelllinien zu replizieren. Krautwurst Et Al. zuerst die ersten 20 Aminosäuren von Rhodopsin (Rho-Tag) an die N-terminale OR Protein und dies förderte die Zelloberfläche Ausdruck von einigen ORs in menschlichen embryonalen Niere (HEK) Zellen20. Durch eine serielle Analyse der Genanalyse Ausdruck (Salbei) Bibliothek aus einzelnen Korrelationsmöglichkeiten Saito Et Al. zuerst geklont, die Rezeptor-der Transport von Protein (RTP) Familienmitglieder, RTP1 und RTP2 und der Rezeptor Ausdruck Enhancer Protein 1 (REEP1), das or Menschenhandel an der Zellmembran erleichtert und verbessert Duftstoff-vermittelten Reaktionen der ORs in HEK293T Zellen 21. Aufbauend auf diesen Erkenntnissen, Matsunami Gruppe erfolgreich etabliert die Hana3A-Zell-Linie mit RTP1 und RTP2, REEP1 sowie GαOlf in HEK293T stabil transfiziert und vorübergehend mit Rho-Tags ORs für effiziente oder funktionale transfiziert Ausdruck. Nachfolgende Studien zeigte (1) eine kürzere Form der RTP1, RTP1S, die stärker zu fördern oder funktionieren als das ursprüngliche RTP1 Protein und (2) der Typ 3 Muskarin Acetylcholin-Rezeptor (M3R), die OR-Aktivität über Hemmung der β-arrestin-2 verbessern könnte Rekrutierung, beide auf der heterologen Expressionssystem experimentelle Optimierung eingeführt wurden Ausgabe22,23.
Verschiedene Nachweismethoden wurden zur Aktivierung des Rezeptors in heterologen Systemen zu quantifizieren. Die sekretierten plazentare alkalische Phosphatase (SEAP) Assay arbeitet mit einem Reporter Enzym transcriptionally geregelt cAMP Response-Elemente (CREs), so dass es eine attraktive Option für die Beurteilung der OR-Aktivierung. Die Fluoreszenz wird leicht in einer Probe des Kulturmediums nach der Inkubation mit SEAP Erkennung Reagenz24erkannt. Mit dieser Methode charakterisiert die Funktionen der Regionen in äußerster Randlage sowie eine sekundäre Klasse chemosensorische Rezeptoren, ausgedrückt in der OE-die Spur Amin-assoziierte Rezeptoren (TAARs) wurden25,26,27. Eine weitere gängige Methode, die Luciferase Assay verwendet ein Glühwürmchen Luciferase Reporter-gen unter der Kontrolle des cAMP Response-Element (CRE). Messung der Lumineszenz von Luciferase Produktion erzeugt stellt eine effiziente und robuste Möglichkeit zur Quantifizierung OR Aktivierung10,11,28.
Echtzeit-cAMP Assays haben auch verbreitet in dynamisch die Überwachungsfunktion der heterologen oder endogene GPCRs. Ein Beispiel für solche erweiterten Tests nutzt eine genetisch codierte Biosensor-Variante, die eine cAMP-bindende Domäne verschmolzen zu einer mutierten Form der Luciferase besitzt. Wenn Lager bindet, führt die Konformationsänderung zur Aktivierung der Luciferase, Lumineszenz von denen dann mit einem Chemilumineszenz Leser29,30gemessen werden kann. Die Echtzeit-cAMP Technologie ist geeignet für die de-Verwaisung des menschlichen Geruchsstoff Rezeptoren in HEK293 und NxG 108CC15 Zellen berichtet wordenArsch = "Xref" > 31,32,33, wie sowie in die HEK293T abgeleitet Hana3A34,35Zellen. Die Krautwurst-Gruppe auch beschrieben im Detail die Echtzeit-cAMP-Technologie, um für Bi-direktionale groß angelegte oder Screening Ansätze32,33geeignet.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Messung der OR-Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay in Hana3A Zellen. In diesem Protokoll wird die Lumineszenz von Pre äquilibriert lebenden Zellen für 30 min. nach der Behandlung mit bestimmten flüchtige Verbindungen, die eine effiziente und genaue Analyse der OR-Aktivierung, die weniger anfällig sind, kinetisch gemessen. Artefakte, die in der zellulären Umgebung mit längerer Zeit und Geruch-induzierte Zelle Toxizitäten auftreten. Diese Echtzeit-Messung ermöglicht eine großangelegte Screening von Regionen in äußerster Randlage und Liganden sowie Charakterisierung von spezifischen OR-Ligand Paaren von Interesse. Mit dieser Methode haben wir erfolgreich OR5AN1 als Rezeptor für den Moschus zusammengesetzten Muscone durch eine Abschirmung gegen 379 menschlichen ORs durchführen und anschließend bestätigen das positive Screening-Ergebnis.
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Protocol
1. Culturing und Wartung von Hana3A Zellen
- pflegen Zellen in 10 mL minimale wesentliche Medium (MEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 100 µg/mL Penicillin-Streptomycin und 1,25 µg/mL Amphotericin B in einem 100-mm Zelle Kulturschale in einem 37 ° C Zelle Kultur Inkubator mit 5 % CO 2. Mit jeder anderen Passage hinzufügen 1 µg/mL Puromycin Aufrechterhaltung beständigen Transfection Plasmide (siehe Einleitung).
Hinweis: Führen Sie alle Schritte mit Zellkultur in einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank, steriles Umfeld zu gewährleisten. - Subkultur in einem Verhältnis von 10-20 % in 100 mm Gerichte alle 2-3 Tage.
2. Galvanischen Zellen zur Transfektion
- beobachten die Hana3A Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop Zellviabilität sicherzustellen und Zusammenfluss schätzen.
- Aspirieren Sie alle Mittel aus der Zelle Kulturschale.
- Zellen durch Hinzufügen von 10 mL von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf den Teller, wirbeln die Schüssel und Absaugen der PBS waschen.
- Add 3 mL 0,05 % Trypsin-Ethylen Diamin Tetraacetic Säure (EDTA) auf den Teller. Mischung für 1 Minute oder bis alle Zellen flott sind.
Hinweis: Beachten Sie den Fortschritt der Zellen von der Unterseite der Platte unter dem Mikroskop nach Bedarf abnehmen. - Inaktivierung Trypsin durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS und Pipette rauf und runter zu brechen, Brocken von Handy-Messe
Hinweis: Für die Beschichtung vor Transfektion, sollte das verwendete Medium nicht Antibiotika enthalten. Zugabe von Antibiotika kann die Transfektion Effizienz verringern. - Übertragung eine entsprechende Menge an Zellen zu einem 15-mLl-Schlauch abhängig von der Anzahl der Platten zu transfiziert werden. Für jede 96-Well-Platte, Platte 2 x 10 6 Zellen oder ca. 1/5 der 100 % konfluierende 100 mm Platte geben eine Zellzahl von 2 x 10 4 Zellen pro Brunnen oder eine Dichte von ca. 15-30 % Zusammenfluss pro Bohrloch. Röhren bei 200 X g für 5 min Zentrifugieren und aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet.
Hinweis: Berechnen Sie die richtige Menge an Zellen auf 96-Well-Platten zu vermeiden, Verwilderung oder undergrowing Zellen vor Stimulation vernickelt werden. - Hinzufügen eine entsprechende Menge an MEM mit 10 % FBS in der 15 mL tube und pipette rauf und runter zu brechen, Brocken der Zelle Masse. Für jede 96-Well-Platte Aufschwemmen der Zellen mit 6 mL MEM mit 10 % FBS.
Hinweis: Achten Sie darauf, Luftblasen in das Rohr zu erzeugen. - Die suspendierten Zellen hinzufügen in einen Stausee. Mit einer Mehrkanal-Pipette, pipette 50 µL Zellen auf jedem Bohrloch einer 96-Well-Platte. Inkubation über Nacht bei 37 ° C mit 5 % CO 2.
3. Transfektion von Plasmiden
- vor Transfektion, beobachten die vergoldeten Zellen gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von ca. 30-50 % pro Bohrloch unter dem Phasenkontrast-Mikroskop und zurück in den Inkubator.
- Vorbereitung im Vorfeld der Rho-Tags OR Konstrukt 11 , 21 , 22 , 28, baut der Zubehör-Faktor (RTP1S 22 , 36 und M3R 23), und die Biosensor-Variante 29 , 30 von Miniprep konstruieren. Die DNA-Konzentration von einem Spektrophotometer zu quantifizieren und Plasmid-DNA-Konzentrationen (z.B. zu 100 ng/µL) mit destilliertem Wasser nach Bedarf anpassen.
- Vorbereitung der Transfektion Mischungen
- bereiten eine Plasmid Transfektion Mischung in 500 µL MEM für jede 96-Well-Platte gemäß Tabelle 1.
Hinweis: Wenn verschiedene Regionen in äußerster Randlage auf der gleichen 96-Well-Platte getestet werden, das Volumen der Transfektion Mischung und die Höhe der Plasmid DNA hinzugefügt muss angepasst werden in Abhängigkeit von Anzahl der transfizierten Bohrungen mit einem bestimmten OR. - Vorbereiten einer Transfektion Mischung in einem Rohr mit 18 µL der Lipid-vermittelte Transfektion Reagenz in 500 µL MEM.
- bereiten eine Plasmid Transfektion Mischung in 500 µL MEM für jede 96-Well-Platte gemäß Tabelle 1.
- Mischen die Plasmid-Mischung mit der Transfektion Mischung von Pipettieren rauf und runter. Inkubation bei Raumtemperatur für 15 min.
- Die Reaktion zu stoppen, durch Zugabe von 5 mL MEM mit 10 % FBS.
- Erstreckt sich eine dicke Schicht von sterilen Papiertüchern in der Zelle-Kultur-Haube. Nehmen Sie eine 96-Well-Platte mit Zellen aus dem Inkubator. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf den Haufen von Papiertuch antippen, so dass das Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird.
Hinweis: Mit Nachdruck oder abrupt Tippen Sie nicht die Platte wie man Zellen verlieren könnte. - 50 µL der kombinierten Transfektion Mischung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte zu übertragen und über Nacht inkubieren 18-24 h bei 37 ° C mit 5 % CO 2.
Hinweis: Ein Mal geschafft Transfektion und Stimulation Zeitplan sollte die Messung vorausgehen, wenn mehr als eine 96-Well-Platte werden in einem einzigen Experiment getestet, um alle Platten nach Transfektion gleichzeitig und Belichtungszeit Reiz gemessen haben.
4. Stimulation und Messung oder Aktivität unter Verwendung der Real-Time-cAMP-Test
- beobachten die transfizierten Zellen unter dem Phasenkontrast-Mikroskop zu gewährleisten einen ordnungsgemäße Zusammenfluss von 50-80 % pro Bohrloch und zurück in den Inkubator.
- Bereiten die Stimulation Medium durch Zugabe von 10 mM Hydroxyethyl Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) und 5 mM Glukose zu Hank ' s ausgewogen Salz Lösung (HBSS).
- Tauen die Echtzeit-cAMP Assay Substrat Reagenz Aliquote auf Eis. Substrat-Reagenz bei-80 ° C bei 55 µL pro Röhre in PCR Röhren aufbewahren. 1 Tube pro Platte verwenden.
- Bereiten Sie 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung durch Mischen von 55 µL des Reagenz Substrat und 2750 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung.
- Erstreckt sich eine dicke Schicht von Papierhandtüchern auf der Bank. Sanft und immer wieder die Platte umgedreht auf das Papiertuch antippen, so dass die Transfektion Medium vom Küchenpapier vollständig absorbiert wird.
- Waschen die Zellen von 50 µL HBSS/HEPES/Glukoselösung in jede Vertiefung pipettieren.
- Sanft und immer wieder zu erschließen, die HBSS/HEPES/Glukose-Lösung aus der 96-Well-Platte.
- Pipette 25 µL 2 % Gleichgewichtherstellung Lösung zu jedem gut und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 2 h.
- Vorbereitung im Vorfeld 1 M Geruchsstoff Stammlösungen in DMSO und Store bei-20 ° C bis verwendet.
- Vor dem Ende der Inkubationszeit Verdünnen der Geruchsstoff Stammlösungen arbeiten Konzentrationen in HBSS/HEPES/Glucose Stimulation Medium.
Hinweis: Die Konzentrationen von der Geruchsstoff Verdünnungen in diesem Schritt vorbereitet sollte verdoppelt, um die korrekte Endkonzentrationen in jede Vertiefung ergeben. - Mit einem Chemilumineszenz Platte Leser und vor Zugabe der Geruchsstoff, messen die basalen Lumineszenz der Platte 2 Mal hintereinander mit einer Rate von 1000 ms pro gut 34.
- Schnell die Platte aus dem Teller Leser zu entfernen und fügen 25 µL Geruchsstoff Verdünnungen in jede Vertiefung und kontinuierliche Lumineszenz Messung alle Brunnen für 20 Zyklen sofort starten innerhalb von 30 min.
Hinweis: Pipette vorsichtig zur Vermeidung einer Kontamination benachbarter Brunnen, bei Verwendung von verschiedenen Riechstoffen und/oder unterschiedliche Konzentrationen der gleichen Geruchsstoffe in der gleichen Platte.
5. Analyse der Daten
- exportieren Sie die Daten aus der Chemilumineszenz-Platte-Reader-Software.
- Calculate normalisiert OR Antwort für jeden Zeitpunkt mit Hilfe der Formel
(Lumineszenz N – Lumineszenz basale) / (Lumineszenz höchste – Lumineszenz basale)
wo N = Lumineszenz-Wert eines bestimmten gut; basale = durchschnittliche Lumineszenz-Wert der beiden basalen Lumineszenz-Werte; höchste = höchsten Lumineszenz-Wert einer Platte oder eine Reihe von Platten.
Hinweis: Je nach Zweck des Experiments, alternative grafische Darstellungen angenommen werden können. Zum Beispiel für screening-Tests (siehe Abbildung 1) und zur Erzeugung von Konzentration-Wirkungs-Kurven, die Lumineszenz-Wert eines Brunnens zu einem gewünschten Zeitpunkt während der kinetischen Messung, z. B. den maximalen Wert oder die Endwert, verwendet werden.
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Representative Results
Muscone ist die wichtigste aromatische Komponente aus natürlichen Moschus. Aktuelle Studien identifizierten OR5AN1 als menschliche Rezeptor für Muscone und andere makrozyklische Moschus-Verbindungen basierend auf Homologie auf die Maus oder MOR215-1, von Muscone eine geschlechtergerechte Glomeruli im Verhalten der Mäuse37,38geklont. Durch screening der menschlichen OR Repertoire, unsere Gruppe und der Touhara-Gruppe auch identifiziert OR5AN1 als einen wichtigen Rezeptor für zwei makrozyklische Moschus-Verbindungen, Cyclopentadecanone und Muscone, bzw. mittels die Luciferase Assay System38,39 .
Mit der Echtzeit-cAMP-Test beschrieben hier, haben wir die menschlichen OR Repertoire gegen 30 µM Muscone (Abbildung 1) überprüft. Unter 379 menschlichen Regionen in äußerster Randlage abgeschirmt entstanden OR5AN1 mit einer prominenten Reaktion auf Muscone, während andere Regionen in äußerster Randlage und den Negativkontrollen (keine-Geruchskontrolle und die leeren Vektor-Kontrolle) keine signifikante Reaktion zeigten. Die Positivkontrolle getestet OR5AN1 gegen 30 µM Moschus Tibetene, ein Ligand für OR5AN1 (unveröffentlichte Daten), und wurde verwendet, um die ORs Reaktion auf Muscone zu normalisieren. Für grafische Darstellung dieser Gruppe von Daten nahmen wir den Zeitpunkt, wenn die maximale Lumineszenz-Lesung für OR5AN1 gegen 30 µM Moschus Tibetene erreicht wurde.
Wir als nächstes untersucht die Konzentration-Wirkungs-Beziehung des Geruchs-OR-paar mit 3 verschiedenen Konzentrationen der Muscone. Für jede Konzentration von Muscone getestet, während die ersten 20 min nach Muscone Zugabe die Reaktion der OR5AN1 schrittweise erhöht und dann Plateau in den letzten 10 min (Abb. 2A), während die Ablaufverfolgung für die keine-Geruch-Zusatz-Steuerung (0 µM Muscone) blieb relativ flach. Höhere Konzentrationen von Muscone hervorgerufen stärkere OR Antworten als die unteren, die während der Messung zu unterscheiden ist. Mit der letzten Zeitpunkt von der kinetischen Messung erzielten wir eine Konzentration-Wirkungs-Kurve und die Konzentration für 50 % der maximalen Wirkung (EG50) Wert der Kurve wird voraussichtlich 20.82 µM (Abb. 2 b).
Abbildung 1: Screening für menschliche ORs Muscone.
379 einzigartige menschliche ORs liefen gegen 30 µM Muscone mit der Echtzeit-cAMP-Test. Farbige Blöcke entlang der x-Achse zeigen verschiedene menschliche OR Familien. Jede Spalte auf die X-Achse repräsentiert einen einzelnen OR Typ bis auf den letzten drei Spalten, die die Reaktion des OR5AN1 auf 30 µM Moschus Tibetene (Positivkontrolle), die Reaktion des OR5AN1 auf die HBSS/HEPES/Glucose-Lösung (keine-Geruch Negativkontrolle), sind und die Reaktion der Rho-PCI-zu 30 µM Muscone (ein leerer Vektor Negativkontrolle), von links nach rechts. y-Achse repräsentiert normalisierte Lumineszenz bei 30 min nach Geruchsstoff Zugabe, wenn die Antwort ein Maximum für die Positivkontrolle erreicht (N = 3). Alle Antworten sind auf die Positivkontrolle normalisiert. Fehlerbalken darzustellen Standardfehler bedeuten (SEM). Aus Gründen der Übersichtlichkeit werden nur positive Fehlerbalken angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Kinetische Messungen der Reaktion des OR5AN1 auf Muscone.
(A) Echtzeit-Messungen der OR5AN1 Aktivierung durch Muscone der verschiedenen Konzentrationen und eine Negativkontrolle kein Geruch wurden innerhalb von 30 min der Duftstoff Zusatz. Pfeil zeigt den Zeitpunkt der Duftstoff Zusatz. (B) Konzentration-Wirkungs-Kurve des OR5AN1 gegen Muscone bei 30 min nach Geruchsstoff Zugabe. y-Achsen darstellen normalisierte Lumineszenz (N = 3). Alle Antworten sind auf die höchsten Antwort auf 100 µM Muscone normalisiert. Fehlerbalken darzustellen SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
| Plasmid | Betrag pro 96-Well-Platte (µg) |
| Rho- oder | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0,5 |
| cAMP Biosensor-Variante | 1 |
Tabelle 1: Komponenten des Gemisches Transfektion.
Pro 96-Well-Platte die Rho-OR, RTP1S, M3R und Echtzeit-cAMP Biosensor Variante Plasmide.
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Discussion
Genaue Messung eine OR-Aktivierung nach Exposition gegenüber einem bestimmten Geruchsstoff ist der erste Schritt bei der Entschlüsselung der Codierung der Geruchsinformation. Die Experimente gezeigt, die ein Beispiel wie man über ein in-vitro- identifizieren kann, die in dieser Studie OR Expressionssystems, reaktionsschnelle ORs unter dem menschlichen OR Repertoire für die duftende Chemie-und anschließend Charakterisierung des Rezeptors Pharmakologie mit verschiedenen Konzentrationen der Chemikalie. Unsere Ergebnisse bestätigen OR5AN1 als Bona Fide Rezeptor für Muscone. Dies steht im Einklang mit einem vorherigen Bericht39 und liefert weitere Beweise für die Spekulation, dass nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren beteiligt sind, in der Sensorik Moschus Geruch27,40. Im Vergleich mit den Screening-Daten von Sato-Akuhara Et Al. , die durch die Luciferase-Assays auf eine ähnliche oder heterologen Expressionssystem generiert wird, zeigte unsere Screeningergebnisse etwas schlechter Signal-Rausch-Verhältnis. Neben den Variationen, die die verschiedenen Techniken beteiligt könnte der Unterschied in der Ausgabe sein, da wir eine geringere Muscone Konzentration (30 µM vs. 100 µM) verwendet. In der Tat ist der EG50 Wert der Konzentration-Wirkungs-Kurve von OR5AN1 gegen Muscone erhalten wir über die Echtzeit-cAMP Assay in der gleichen Größenordnung wie der Sato-Akuhara Et Al. in ihrem Luciferase Assay System erhalten, vergleichbare Ergebnisse für gleiche heterologen OR Expressionssystems auch demonstrieren, wenn verschiedene Nachweismethoden verwendet werden. In einer anderen Studie fand unsere Gruppe, dass die Echtzeit-Lagersystem möglicherweise etwas empfindlicher als die Luciferase Reporter-gen-System bei der Beurteilung der OR2T11-Rezeptor-Selektivität, angesichts der Tatsache, dass eine kleine Anzahl von Geruchsstoffen nur aktiv in der ehemaligen aber nicht in der letzteren waren System35. Im Vergleich mit den Daten von Geithe Et Al. berichtet 31 am OR1A1 gegen (+)-Carvon, unsere Daten auf OR5AN1 gegen Muscone zeigte eine Verzögerung in den Zeitaufwand zum Plateau zu erreichen, die direkt aus den unterschiedlichsten Regionen in äußerster Randlage und Geruchsstoffe verwendet ergeben könnten. In anderen Echtzeit-cAMP Assay Angaben aus unserer Gruppe zeigten wir auch unterschiedliche Zeiten abhängig von den Regionen in äußerster Randlage und Geruchsstoffe34,35einen Höchstwert. Darüber hinaus verschiedene Zelllinien verwendet, um Regionen in äußerster Randlage auszudrücken, verschiedene Substrat verwendet, verschiedene Echtzeit-cAMP Biosensor Variante Plasmide, unterschiedliche Empfindlichkeit der Chemilumineszenz Platte Leser und/oder verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie z. B. Variation in Raumtemperatur, könnten alle Variationen in Lumineszenz Ausgabe beitragen.
Der Echtzeit-cAMP-Test zeigt mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden zur Messung der OR-Aktivierung. Erste, ähnlich wie bei der Luciferase Reporter-gen-Test, ermöglicht die Echtzeit-cAMP-Assay eine zusätzliche in-vitro- Hochdurchsatz-Identifizierung der OR-Repertoires, die Beantwortung von Geruchsstoffen. Groß angelegte Rezeptor und/oder Duftstoff Bildschirme durch die Echtzeit-cAMP-Test können eine große Menge von Informationen über Rezeptor-Geruch Paarung mit dem Einsatz einer kleinen Anzahl von Platten anbieten. Wenn erweiterte Luminometer und Pipettier Roboter gibt, das hier beschriebene 96-Well-Protokoll zu einem 384-Well-Format, in denen noch weniger Plasmid DNA leicht erweiterbar und Reagenzien pro Outputeinheit Daten erforderlich sind. Zweitens ist die Echtzeit-cAMP-Methode in der Lage, Veränderungen in der intrazellulären Konzentration von cAMP in Echtzeit zu messen. Während die meisten Tests zur Messung der OR Tätigkeit bis dato Fluoreszenz oder Chemilumineszenz-basierten Endpunkt Erkennung erfordern Zelle Lyse sind, die Echtzeit-cAMP assay Isimplemented Bedingungen nicht-lytische, Leben-Zellen, die mehr Ähnlichkeit mit den endogenen Situation und die ermöglichen Überwachung von Änderungen im cAMP Ebenen. Drittens ist eine relativ kurze Zeit erforderlich, die Echtzeit-Methode durchführen. Ein weiterer Hochdurchsatz-Analysemethode der oder-Funktion, die auf eine Luciferase Reporter-gen-Expression angewiesen ist, braucht weitere 4 h nach dem Geruch Stimulation um ein Experiment zu vervollständigen. In einigen Fällen führen eine anhaltende Geruch Inkubation Intervall potenzielle Geruchsstoff Toxizität für Zellen, die vorübergehende Unterbelichtung effektiv gelindert wird. Darüber hinaus sind die Chancen für die Kontamination von benachbarten Brunnen durch Verflüchtigung bei Verwendung von verschiedenen Riechstoffen und/oder verschiedenen Konzentrationen von den gleichen Geruchsstoff in der gleichen Platte in länger anhaltende Experimente ebenfalls gestiegen. Sofortige Erkennung nach Geruch-Zusatz macht dem Echtzeit-cAMP-Test eine schnelle und zuverlässige Paradigma.
Die Grenzen des Lagers Echtzeit-assay für die Messung oder die Aktivierung ist wie folgt. Zunächst unsere in-vitro- Assay eine HEK293T abgeleitet Zelllinie beruht auf viele endogene Moleküle der native olfaktorischen sensorischen Neuronen fehlt. Darüber hinaus können lösliche Proteine und enzymatische Umwandlungen, die in das Nasensekret mit Geruchsstoffe binden und/oder OR die Affinität für Geruchsstoffe zu beeinflussen. Daher kann der in-Vivo -Situation in Bezug auf Empfindlichkeit und Geruch tuning Aktivierung im heterologen System abweichen. Zweitens erfordert die Ermittlung von ORs für einen bestimmten Geruchsstoff eine gesamte OR Repertoire mindestens einer bestimmten Art. Regionen in äußerster Randlage sind eine große Familie von GPCRs und die Nummern der OR-Proteine in der Human- und Maus sind sehr groß,4,5,41. Viel Zeit und Mühe können beteiligt Klonen jedes OR Repertoire von Interesse. Drittens: Obwohl der heterologen Expressionssystem OR OR Sequenz Änderungen (z. B. die Rho-Tag) und einige der wichtigsten oder Zubehör Proteine (z. B. RTP1S und M3R) enthalten sind, wir vermuten, dass nicht alle Regionen in äußerster Randlage funktional auf der Zellmembran exprimiert werden die HEK293T-abgeleitete Zellen. Daher schließt das Fehlen von Reaktionen auf einen bestimmten Geruchsstoff in Vitro nicht aus unbedingt OR Antwort in Vivo, aufgrund der Tatsache, dass einige Regionen in äußerster Randlage nur schlecht ausgedrückt auf der Zelloberfläche und nicht in der Lage, ihre Liganden zu erkennen sein können. So sollte wann immer möglich in Echtzeit cAMP in Verbindung mit anderen in Vitro und in Vivo Tests verwendet werden, um überzeugendere Ergebnisse zu erzielen.
Mehrere wichtige Schritte sollte besondere Aufmerksamkeit während der Echtzeit-cAMP-Test gegeben werden. Erstens für Experimente mit Lumineszenz im Allgemeinen, ist Temperatur ein wichtiger Faktor, der das Ergebnis des Experiments beeinflusst wie steigenden Temperaturen basale und induzierte der Lichtleistung senken und Rückgang der Temperatur Lichtleistung erhöhen. Daher Äquilibrierung vorab der Platten auf die stationäre Betriebstemperatur von der instrumeNT vor der Zugabe der Geruchsstoff ist notwendig, den Einfluss auf die Ergebnisse, die durch Temperaturwechsel verursacht zu vermeiden. Zweitens sollten die Konzentrationen von Echtzeit-cAMP Assay Substrat Reagenz entsprechend tatsächlichen Situation angepasst werden. Wenn die basalen Lumineszenz nicht die niedrigste Nachweisgrenze der Chemilumineszenz-Platte-Leser zu erreichen, sollte man überlegen, Erhöhung der Substrat-Konzentrationen um Signal zu erhöhen. Zu guter Letzt können trotz des Seins eine adhärente Zell-Linie, Hana3A Zellen während des Experiments lösen. Beim Absaugen oder das Medium hinzufügen, kann die Platzierung der Pipettenspitzen an der Seite des Brunnens Störung der Zelle Monolage minimieren. Es ist auch wichtig, Platte Zellen in eine angemessene und gleichmäßige Dichte zu vermeiden, überwuchert von Zellen als dichte Flecken von Zellen neigen dazu, beim Wechsel des Mediums abziehen.
Neben der Identifizierung OR(s) für einen Geruchsstoff von Interesse, die Echtzeit-cAMP-Assay kann auch verwendet werden zum Bildschirm für cognate Liganden für einen gegebenen OP Wann stehen die Bibliotheken von Chemikalien. Schließlich, wenn entsprechende Zelltypen und Transfektion Bedingungen verwendet werden, der Test kann auch ermöglichen die Erkennung von überexprimieren oder endogene GPCR-Aktivierung und geben Konzentration abhängig Wirkungskurven für Agonisten und Antagonisten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Arbeit wurde von der chinesischen National Science Foundation (31070972), Wissenschaft und Technologie Kommission der Shanghai Municipality (16ZR1418300), das Programm für Innovative Forschung Team des Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai östlichen unterstützt. Scholar Program (J50201) und das nationale Grundlagenforschung Programm von China (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
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