Summary
אפיון הפונקציה של קולטני odorant מגישה חלק חיוני בתהליך deorphanization. אנו מתארים שיטה למדוד את ההפעלה של רצפטורים odorant בזמן אמת באמצעות וזמינותו של המחנה.
Abstract
הגודל העצום של odorant בתרבית של קולטן (או אר) משפחות נוכח הקשיים למצוא שלהם ליגנדים cognate בקרב רבים כימיקלים נדיפים. כדי ביעילות ובדייקנות deorphanize ORs, אנו משלבים את השימוש קו תא heterologous לבטא ORs בתרבית של פלסמיד ביוסנסור ששונה גנטית כדי למדוד את הייצור המחנה במורד הזרם של הפעלה או בזמן אמת. Assay הזה יכול לשמש odorants מסך נגד ORs, ולהיפך. אינטראקציות חיוביות קולטן odorant מן המסכים יכולים לאשר לאחר מכן על-ידי בדיקת נגד ריכוזי ריח שונים, יצירת עקומות הריכוז-תגובה. כאן השתמשנו בשיטה זו כדי לבצע הקרנה תפוקה גבוהה של תרכובת מדיף נגד ספריה או האדם הביע בתאים Hana3A, אישר כי הקולטן מגיב באופן חיובי הוא רצפטור המתחם עניין cognate. מצאנו שיטה זו זיהוי תפוקה גבוהה כדי להיות יעיל ואמין בהערכת או הפעלה, הנתונים שלנו מספקים דוגמה של השימוש פוטנציאל במחקרים תפקודית או.
Introduction
חוש הריח ממלא תפקיד חשוב בהישרדות של בעלי החיים כפי שהם מסתמכים על יכולותיהם חוש הריח כדי להשיג מזון, להימנע טורפים של סכנה, להבחין בין המינים ובחר חבר1,2. מימוש פונקציות אלה תלויה קולטני odorant (ORs), אשר באים לידי ביטוי באופן אינדיבידואלי על פני השטח ciliary של חוש הריח החישה הניריונים (OSNs) ממוקם האפיתל חוש הריח (OE). ORs מהווים משפחה של superfamily קולטן (GPCR) G-חלבון בשילוב עם 400 ל 1200 מגוונות או גנים-אנוש בין הגדולות העכבר, בהתאמה3,4,5. ORs מופעל על ידי odorants מוביל ונאמנותם המחנה תאיים באמצעות הפעלת רציפים של חוש הריח, חלבון G (Golf) והקלד cyclase adenylyl השלישי (ACIII). הרמה מוגברת וכתוצאה מכך של מחנה תאיים שיכלה לשמש כשליח השני, אשר פותח את הערוץ ממותגת נוקלאוטיד על פני התא, מפעילה זרם של קטיונים כולל2 + Ca, פוטנציאל פעולה, ויזמות בסופו של דבר נוירו-פוטנציאל שידור ותפיסה חוש הריח. התהליך של איתור של האפליה מספר רב של odorants על ידי חברת ORs נחשב הצעד הראשון של התפיסה חוש הריח6,7.
כיוון באק, אקסל8 ראשון בהצלחה לשכפל odorant רצפטורים מבואר המנגנון של חוש הריח תפיסה שיזם ORs, deorphanization של המשפחה או הפך לאחד נקודות חמות בתחום זה. שיטות שונות בתוך, לשעבר vivo ו- in vitro לקשרי כדי למדוד או הפעלה כבר דווח על9,10,11,12. שיטה מסורתית בשימוש Ca2 + הדמיה ואחריו תא בודד RT-PCR-OSNs זמין הזיהוי של ORs שונים אליפטיות odorants13,14,15. לאחרונה, כניסתו של ניתוחים transcriptome בקנה מידה גדול קודם בפיתוח שיטות יותר תפוקה גבוהה ויוו . וזמינותו קנטאקי מזוהה ORs העכבר eugenol, muscone-מגיב עם השימוש של S100a5-tauGFP כתב בעכבר microarray והתאמצות ניתוח9. בהתבסס על הירידה ברמות mRNA או לאחר חשיפה odorant, הטכנולוגיה החלום מועסקים בגישה transcriptomic כדי לקבוע או פרופילים הפעלת שני מינים שאינם בעלי חוליות חוליות16. באופן דומה, בהתחשב זירחון של S6 בהפעלות עצביים, Matsunami הקבוצה mRNAs ברצף של הריבוזום phosphorylated immunoprecipitations כדי לזהות ORs מגיב12. בסופו של דבר, הקבוצה פיינשטיין דיווח עכברים סופר סניפר העשויה לשמש כפלטפורמה ללמוד ריח קידוד ויוו, המכונה ה-טכנולוגיית MouSensor17.
בממלכת במבחנה , האתגר של culturing OSNs הופך את מערכת heterologous ביטוי המחקה או ביטוי פונקציונאלי ויוו הפתרון האידיאלי לערוך סינון בקנה מידה גדול של כימיקלים מדיף עבור ORs. עם זאת, מאז שורות תאים בתרבית של מקורות-חוש הריח נבדלים OSNs מקורי, או חלבונים נשמרים באת רשתית תוך-פלזמית ללא אפשרות תנועה כדי קרום פלזמה, וכתוצאה מכך או השפלה ואובדן של קולטן פונקציה18 , 19. כדי לפתור בעיה זו, נעשו עבודות נרחב כדי לשכפל או ביטוי פונקציונלי על קרום התא של שורות תאים heterologous. . Krautwurst et al. מצורף קודם את הראשון 20 חומצות אמינו אופסין # רודופסין (Rho-תג) N-הטרמינל או חלבון, זה קידום הביטוי תא-השטח של כמה ORs תאי כליה אנושית עובריים (HEK)20. על-ידי עריכת ניתוח טורי של הביטוי (מרווה) ספריית מפענוח הגנום מ OSNs יחיד, סאיטו ואח. תחילה משובטים הובלת הקולטן חלבון (RTP) בני המשפחה, RTP1, RTP2, קולטן ביטוי משפר החלבון 1 (REEP1) הקלו או סחר על קרום התא ו משופרת odorant בתיווך התגובות של ORs בתאים HEK293T 21. על סמך ממצאים אלה, הקבוצה Matsunami בהצלחה הקים קו תא Hana3A, stably transfected עם RTP1, RTP2, REEP1 ו- Gαolf ב HEK293T ו transiently transfected עם ORs מתויג רו, יעיל או פונקציונלי ביטוי. לאחר מכן שמחקרים גילו 1) טופס קצר יותר של RTP1, RTP1S, יותר robustly לקדם או לתפקד מאשר החלבון RTP1 המקורי ו- 2) סוג 3 קולטן מוסקריני (M3R) זה יכול לשפר את הפעילות או באמצעות עיכוב של β-arrestin-2 גיוס, אשר שניהם הוכנסו למערכת ביטוי heterologous כדי למטב את ניסיוני פלט22,23.
מספר זיהוי שיטות השתמשו כדי לכמת את הפעלת קולטן במערכות heterologous. וזמינותו המופרש היפרדות אלקליין פוספטאז (SEAP) פועלת עם אנזים כתב transcriptionally מוסדר על ידי תגובת מחנה אלמנטים (קרס), שהופך אותו אופציה אטרקטיבית להערכת או הפעלה. ידי קרינה פלואורסצנטית מזוהה בקלות במדגם של המדיום תרבות לאחר הדגירה עם ריאגנט לזיהוי SEAP24. באמצעות שיטה זו, הפונקציות של ORs, כמו גם מחלקה משנית של קולטני chemosensory לידי ביטוי המעקב OE-קולטנים הקשורים אמין (TAARs) היה מאופיין26,25,27. שיטה נפוצה אחרת, וזמינותו לוציפראז, משתמשת גחלילית לוציפראז מדווח תחת השליטה של הרכיב תגובת מחנה (CRE). מדידת לומינסנציה שנוצר על ידי ייצור לוציפראז מספק אמצעי יעיל וחזק לכמת או הפעלה10,11,28.
מבחני המחנה בזמן אמת גם היה בשימוש נרחב בפיקוח באופן דינמי את תפקוד GPCRs heterologous או אנדוגני. דוגמה אחת כזו מבחני מתקדם מנצל variant ביוסנסור מקודדים גנטית, אשר ברשותה תחום מחייב מחנה דבוקה צורת לוציפראז מוטציה. כאשר cAMP נקשר, לשינוי הסתגלותי מוביל ההפעלה של לוציפראז, הפריה חוץ גופית שממנו ואז ניתן למדוד עם29,קורא30chemiluminescence. הטכנולוגיה המחנה בזמן אמת דווחה מתאים דה-orphaning של קולטני odorant האנושי בתאים 108CC15 HEK293 ו- NxGהתחת = "xref" > 31,32,33, כמו גם Hana3A HEK293T, נגזר תאים34,35. הקבוצה Krautwurst גם תיאר בפירוט את הטכנולוגיה המחנה בזמן אמת מתאים בגישות בקנה מידה גדול או הקרנת דו כיווני32,33.
כאן נתאר פרוטוקול למדידת הפעלה או שימוש assay המחנה בזמן אמת בתאים Hana3A. ב פרוטוקול זה, הפריה חוץ גופית של תאים חיים מראש equilibrated נמדד kinetically במשך 30 דקות לאחר הטיפול עם תרכובות נדיפות ספציפיים, המייצגים ניתוח מדויק ויעיל יותר של הפעלת או כי הם פחות רגישים חפצים המתרחשים בסביבת סלולר עם ריח-induced תא רעילות וזמן ממושך. מדידה בזמן אמת זו מאפשרת הקרנת ORs והן ליגנדים בקנה מידה גדול, כמו גם אפיון של זוגות OR-ליגנד מסוימים של ריבית. באמצעות שיטה זו, אנו בהצלחה מזוהות OR5AN1 רצפטור muscone תרכובת מושק על ידי ביצוע הקרנה נגד ORs האנושי 379 ולאשר לאחר מכן התוצאה חיובית ההקרנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culturing ותאים תחזוקה של Hana3A
- שמור על התאים ב- 10 מ"ל של אמצעי חיוני מינימלי (מאמ) עם 10% עוברית שור סרום (FBS), 100 µg/mL פניצילין-סטרפטומיצין, האמפוריטיצין µg/mL 1.25 B ב- 100-מ"מ תא תרבות מנה בחממה התרבות התא 37 ° C עם 5% CO 2. עם כל קטע אחר, להוסיף 1 puromycin µg/mL כדי לשמור על יציבה תרביות תאים של פלסמידים (ראה מבוא).
הערה: בצע את כל השלבים הכרוכים תרבית תאים בכיתה II בטיחות ביולוגית בארון כדי להבטיח סביבה סטרילית. - תת-תרבות ביחס של 10-20% במנות 100-מ מ כל 2-3 ימים.
2. ציפוי תאים עבור תרביות תאים
- לבחון את התאים Hana3A במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח תא הכדאיות וכדי להעריך את הנהרות.
- תשאף בינוני כל מתוך קערה התרבות התא.
- לרחוץ תאים על-ידי הוספת 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) על צלחת, מתערבל המנה וכ רפה בעברית מגניב.
- להוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין אתילן diamine ב tetraacetic חומצה (EDTA) על צלחת. לערבב 1 דקות או עד כל התאים הם צפים.
הערה: לבחון את ההתקדמות של תאים מתנתקת מהחלק התחתון של הלוח תחת המיקרוסקופ כנדרש. - טריפסין Inactivate על-ידי הוספת 5 מ של הגברת עם 10% FBS, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את נתחי תא מסצ'וסטס
הערה: עבור ציפוי לפני תרביות תאים, אופן השימוש לא לכלול אנטיביוטיקה. תוספת של אנטיביוטיקה עשויה להקטין תרביות תאים יעילות. - להעביר כמות מספקת של תאים צינור 15-mLl בהתאם למספר הצלחות כדי להיות transfected. על כל צלחת 96-ובכן, הצלחת 2 x 10 6 תאים, או כ 1/5 של תבשיל confluent 100 מ מ 100%, נותן ספירת תאים 2 x 10 4 תאים לכל טוב או צפיפות של-15-30% הנהרות לכל טוב. צנטריפוגה צינורות-200 g x עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא.
הערה: לחשב את הסכום הנכון של תאים כדי להיות מצופה על גבי לוחות 96-ובכן כדי להימנע overgrowing או undergrowing תאים לפני גירוי. - להוסיף כמות מספקת של הגברת עם 10% FBS לתוך 15-mL צינור, פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את החתיכות של התא המוני. על כל צלחת 96-ובכן, resuspend את התאים עם 6 מ של הגברת עם 10% FBS.
הערה: הקפד לא ליצור בועות אוויר בצינור. - להוסיף את התאים מושעה לשמורה. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, פיפטה 50 µL של תאים על גבי כל טוב של צלחת 96-ובכן. דגירה בין לילה ב 37 ° C עם 5% CO 2.
3. תרביות תאים של פלסמידים
- לפני תרביות תאים, לבחון את התאים מצופים להבטיח זרימה נאותה של-30-50% לכל טוב במיקרוסקופ ניגוד שלב ולחזור החממה.
- הכן מראש מתויג רו או לבנות 11 , 21 , 22 , 28, הגורם אביזר בונה (RTP1S 22 , 36 ו M3R 23), ולבנות הווריאציה ביוסנסור 29 , 30 מאת miniprep. לכמת את ריכוז הדנ א על ידי ספקטרופוטומטרים ולהתאים פלסמיד ריכוזים דנ א (למשל, כדי 100 ng/µL) עם מים מזוקקים במידת הצורך.
- הכנת תערובות תרביות תאים
- להכין תערובת תרביות תאים פלסמיד ב 500 µL של הגברת כל צלחת 96-ובכן לפי טבלה 1-
הערה: כאשר ORs שונים נבדקים באותה צלחת 96-ובכן, נפח התערובת תרביות תאים ואת מידת פלסמיד דנ א הוסיף חייב להתאים בפונקציה של מספר בארות transfected עם או נתון. - הכן תערובת תרביות תאים בשפופרת עם 18 µL של ריאגנט בתיווך השומנים תרביות תאים ב- 500 µL של לזכור:
- להכין תערובת תרביות תאים פלסמיד ב 500 µL של הגברת כל צלחת 96-ובכן לפי טבלה 1-
- לערבב את התערובת פלסמיד עם התערובת תרביות תאים על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות
- לעצור את התגובה על-ידי הוספת 5 מ של הגברת עם 10% FBS.
- מתפרסת בשכבה עבה של מגבות נייר סטרילי בשכונה התרבות תאים. קח צלחת 96-ובכן עם תאים מן החממה. בעדינות, שוב ושוב הקש את הצלחת הפוך על ערימת נייר מגבת כך המדיום נספג לחלוטין על ידי מגבת הנייר.
הערה: לא בכוח או בפתאומיות הקש על הצלחת כמו אחד יכול לאבד תאי. - להעביר 50 µL של תערובת תרביות תאים המשולב מכל קידוח של צלחת 96-ובכן, תקופת דגירה בלילה של 18-24 h ב 37 ° C עם 5% CO 2.
הערה: ניהול זמן תרביות תאים וגירוי זמנים צריך להקדים את המדידה כאשר צלחת 96-ובכן אחד או יותר נבדקים בניסוי אחד על מנת לקבל את כל הצלחות נמדד לאחר באותו זמן תרביות תאים, זמן החשיפה לגירוי.
4. גירוי, מדידה או פעילות באמצעות וזמינותו מחנה בזמן אמת
- לבחון את התאים transfected במיקרוסקופ ניגוד שלב כדי להבטיח זרימה נאותה של 50-80% לכל טוב ולחזור החממה.
- להכין המדיום גירוי על-ידי הוספת חומצה piperazineethanesulfonic hydroxyethyl 10 מ מ (HEPES) ו- 5 מ מ גלוקוז להאנק ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS).
- להפשיר את המצע assay המחנה בזמן אמת ריאגנט aliquots על הקרח. לאחסן המצע ריאגנט ב- 80 ° C-55 µL למחזור המבחנות. השתמש צינור 1 לכל צלחת-
- להכין 2% equilibration פתרון על ידי ערבוב µL 55 מהתרכובת המצע ופתרון HBSS/HEPES/גלוקוז 2750 µL.
- מתפרסת בשכבה עבה של מגבות נייר על הספסל. בעדינות, שוב ושוב הקש את הצלחת הפוך על מגבת הנייר כך המדיום תרביות תאים נספג לחלוטין על ידי מגבת הנייר.
- לרחוץ את התאים על ידי pipetting 50 µL HBSS/HEPES/גלוקוז לפתרון כל טוב.
- בעדינות, שוב ושוב הקש את הפתרון HBSS/HEPES/גלוקוז מהצלחת 96-ובכן.
- פיפטה 25 µL של 2% equilibration פתרון לכל טוב ואני דגירה בטמפרטורת החדר חשוך בשביל ה' 2
- להכין מראש 1 מ' odorant פתרונות מניות דימתיל סולפוקסיד וחנות ב-20 ° C עד להשתמש.
- לפני סוף זמן הדגירה, לדלל את הפתרונות odorant מניות ריכוזי עובד במדיום גירוי HBSS/HEPES/גלוקוז.
הערה: ריכוזי דילולים odorant מוכן בשלב זה צריך להיות מוכפל להניב הריכוזים הסופית הנכונה היטב לכל. - באמצעות chemiluminescence לוחית רישוי הקורא, לפני חיבור odorant, למדוד את רמת הארה הבזליים של הצלחת עבור 2 פעמים ברציפות בקצב של ms 1000 לכל טוב 34.
- להסיר במהירות את הצלחת מהקורא צלחת, להוסיף 25 µL odorant דילולים מכל קידוח, מיד מתחילים מדידה רציפה הפריה חוץ גופית של בארות כל 20 מחזורים בתוך 30 דקות
הערה: פיפטה בקפידה כדי להימנע מזיהום השכנה בארות כאשר משתמשים odorants שונים ו/או ריכוזים שונים של odorants אותו באותה הצלחת-
5. ניתוח נתונים
- לייצא את הנתונים בתוכנת reader צלחת chemiluminescence.
- חישוב מנורמל או תגובה עבור כל נקודת זמן באמצעות הנוסחה
(הפריה חוץ גופית N – הפריה חוץ גופית הבזליים) / (הפריה חוץ גופית הגבוהה ביותר – הפריה חוץ גופית הבזליים)
שבו N = ערך הפריה חוץ גופית מסויים טוב; הבזליים = ערך הפריה חוץ גופית הממוצע של השניים הבזליים הפריה חוץ גופית ערכים; הגבוה ביותר = הערך הגבוה ביותר הפריה חוץ גופית של צלחת או סט צלחות.
הערה: בהתאם למטרת הניסוי, ייצוגים גרפיים חלופי יכול להיות מאומץ. לדוגמה, עבור הקרנה מבחני (ראה איור 1), ליצירת עקומות הריכוז-תגובה, הפריה חוץ גופית ערך מסויים טוב בנקודת הזמן הרצויים במהלך המדידה קינטי, כגון הערך המרבי או הערך הסופי, יכול לשמש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muscone הוא המרכיב העיקרי ארומטי מ טבעי מושק. אחרונים שהיו בשימוש מחקרים OR5AN1 מזוהה בתור קולטן אנושי עבור muscone ותרכובות מושק אחרות macrocyclic מבוסס על הומולוגיה או העכבר, MOR215-1, שוכפלה מ glomeruli muscone מגיב ב מתנהג עכברים37,38. על ידי הקרנת הרפרטואר או האדם, הקבוצה שלנו, הקבוצה Touhara גם מזוהה OR5AN1 קולטן העיקריים עבור תרכובות מושק בשני macrocyclic, cyclopentadecanone ו- muscone, בהתאמה, באמצעות את לוציפראז assay מערכת38,39 .
באמצעות וזמינותו המחנה בזמן אמת המתוארת כאן, הוקרנו הרפרטואר או האדם נגד מיקרומטר 30 muscone (איור 1). בין ORs האנושי 379 מוקרן, OR5AN1 הופיע בתגובה muscone, בולט בזמן את ORs אחרים ושל הפקדים שלילי (הפקד לא-ריח ו הפקד ריק וקטור) לא הראה תגובה משמעותית. הפקד חיובי כנגדם OR5AN1 30 מיקרומטר מושק tibetene, ליגנד עבור OR5AN1 (פורסמו נתונים), שימש כדי לנרמל ORs' בתגובה muscone. עבור ייצוג גרפי של קבוצת נתונים זו, בחרנו נקודת זמן בעת קריאת הארה המרבי הושג OR5AN1 נגד 30 מיקרומטר מושק tibetene.
בדקנו הבא הגומלין ריכוז-תגובה של הריח-או זוג עם 3 ריכוזים שונים של muscone. עבור כל ריכוז של muscone נבדקו, במהלך הראשון 20 דקות לאחר תוספת muscone, התגובה על ידי OR5AN1 בהדרגה, ואז plateaued בדקות 10 האחרון (איור 2 א) בעוד המעקב עבור הפקד לא-ריח תוספת (0 מיקרומטר muscone) נותרה יחסית שטוח. ריכוז גבוה של muscone עורר תגובות או חזק יותר מאשר אלה נמוך, ניתן להבחנה במהלך המדידה. תוך שימוש בנקודת הזמן האחרון המדידה קינטי, יצרנו עקומת ריכוז-תגובה, הריכוז עבור 50% של אפקט מקסימלי (EC50) ערך של העקומה מוערך 20.82 מיקרומטר (איור 2B).
איור 1: הקרנת עבור ORs האנושית של muscone.
379 ORs אנושי ייחודי הוקרנו נגד 30 מיקרומטר muscone באמצעות וזמינותו המחנה בזמן אמת. בלוקים לאורך xצבעוניים-ציר מצביעים על משפחות שונות או אנושי. כל עמודה על ה- x-ציר מייצג סוג או אחד מלבד שלושת העמודות, המהווים התגובה של OR5AN1 ל 30 מיקרומטר מושק tibetene (פקד חיובי), התגובה של OR5AN1 הפתרון HBSS/HEPES/גלוקוז (לא-ריח שלילי פקד), את התגובה של רו-pCI ל 30 מיקרומטר muscone (וקטור ריק שלילי פקד), משמאל לימין. y-ציר מייצג מנורמל הארה ב 30 דקות לאחר odorant תוספת כאשר התגובה הגיעה מקסימום עבור הפקד חיובי (N = 3). כל התגובות הם מנורמל לפקד חיובי. קווי שגיאה מייצגים אומר שגיאה סטנדרטית (SEM). למען הבהירות מוצגים קווי שגיאה חיובית בלבד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מדידות קינטי של התגובה של OR5AN1 muscone.
(א) בזמן אמת מדידות של הפעלת OR5AN1 על ידי muscone של ריכוזים שונים של פקד שלילי. לא-ריח בוצעו בתוך 30 דקות של odorant בנוסף. החץ מצביע על נקודת הזמן של odorant בנוסף. (ב) בריכוז-תגובת העיקול של OR5AN1 נגד muscone ב- 30 דקות לאחר תוספת odorant. y-צירים לייצג מנורמל הפריה חוץ גופית (N = 3). כל התגובות הם מנורמל על התגובה הגבוהה ביותר כדי 100 מיקרומטר muscone. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פלסמיד | סכום לפי 96-ובכן צלחת (µg) |
| רו- או | 5 |
| RTP1S | 1 |
| M3R | 0.5 |
| ביוסנסור המחנה משתנה | 1 |
טבלה 1: מרכיבי התערובת תרביות תאים.
לכל צלחת 96-ובכן כמות רו-M3R OR RTP1S,, פלסמידים variant את ביוסנסור המחנה בזמן אמת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דיוק מדידה ההפעלה של ניתוח בתגובה לחשיפה odorant מסוימים היא הצעד הראשון לפענח את הקוד של מידע חוש הריח. הניסויים המוצגים מייצגים המחקר הזה שדוגמה של איך אחת יכולה לזהות, באמצעות יישום במבחנה או ביטוי במערכת, ORs מגיב בין הרפרטואר או אנושי עבור החומר הכימי מדיף של עניין לאחר מכן אפיון הקולטן פרמקולוגיה באמצעות ריכוזים שונים של החומר הכימי. התוצאות שלנו אשר OR5AN1 בתור קולטן פיד ה בונה עבור muscone. זה עולה בקנה אחד עם הדו ח הקודם39 ומספקת הוכחה נוספת עבור החששות כי רק מספר קטן של רצפטורים המעורבים חישה מושק ריח27,40. כאשר לעומת הנתונים ההקרנה סאטו-Akuhara. ואח שנוצר על ידי וזמינותו לוציפראז במערכת ביטוי דומה או heterologous, התוצאות ההקרנה שלנו הראה יחס אות לרעש מעט יותר גרוע. מלבד הווריאציות הטבועה של טכניקות שונות מעורבים, ההבדל בפלט יכול להיות בשל העובדה כי השתמשנו ריכוז נמוך יותר של muscone (30 מיקרומטר לעומת 100 מיקרומטר). למעשה, הערך50 EC של עקומת ריכוז-תגובה של OR5AN1 נגד muscone שלנו להשיג באמצעות וזמינותו המחנה בזמן אמת נמצא באותו סדר גודל כמו זו. סאטו-Akuhara et al. שהושג במערכת assay לוציפראז שלהם, הוכחת תוצאות דומות באותה heterologous או ביטוי מערכת אפילו כאשר שיטות איתור שונים משמשים. במחקר אחר, הקבוצה שלנו מצא כי מערכת מחנה בזמן אמת עשוי להיות רגיש מעט יותר מאשר מערכת גנים כתב לוציפראז בהערכת OR2T11 קולטן סלקטיביות, בהתחשב בכך מספר קטן של odorants היו רק פעיל לשעבר אך לא האחרון מערכת35. כאשר לעומת סדרת הנתונים שדווחו על-ידי. Geithe et al. 31 ב OR1A1 נגד (+)-carvone, הנתונים שלנו ב- OR5AN1 נגד muscone הראו עיכוב הזמן הנדרש כדי להגיע אל הרמה, אשר עלול לגרום ישירות מן הסוגים השונים של ORs וריחנים בשימוש. בנתונים אחרים בזמן אמת assay המחנה דיווח של הקבוצה שלנו, גם הראנו משתנות פעמים שיאי בהתאם ORs וריחנים34,35. בנוסף, תאים שונים קווים שנועדה להביע ORs, המצע שונים המשמשים, פלסמידים של וריאציות שונות בזמן אמת ביוסנסור המחנה, רגישות שונה chemiluminescence צלחת הקורא, ו/או תנאים ניסויים שונים, כגון וריאציה בטמפרטורת החדר, יכול כל לתרום הווריאציות בפלט הפריה חוץ גופית.
וזמינותו המחנה בזמן אמת מראה כמה יתרונות על פני שיטות אחרות למדידת או הפעלה. הראשון, הדומה לוציפראז כתב ג'ין וזמינותו, וזמינותו המחנה בזמן אמת מספק אמצעי נוסף במבחנה של תפוקה גבוהה זיהוי של repertoires או להגיב על odorants. בקנה מידה גדול מסכי קולטן ו/או odorant על ידי וזמינותו המחנה בזמן אמת עשוי להציע כמות גדולה של מידע על קולטן-ריח זיווג עם השימוש של מספר קטן של צלחות. כאשר מתקדמים luminometers, רובוטים pipetting הינם זמינים, פרוטוקול 96-ובכן המתוארים כאן ניתן לשדרג בקלות לתבנית 384-ובכן, באילו פלסמיד אפילו פחות דנ א, ריאגנטים נדרשים לכל יחידת פלט הנתונים. שנית, שיטת מחנה בזמן אמת הוא מסוגל מדידת שינויים בריכוז תאיים מחנה בזמן אמת. בעוד רוב מבחני למדידת פעילות או לתאריך זריחה או chemiluminescence מבוססת על הקצה של זיהוי דרישת תא פירוק, המחנה בזמן אמת assay isimplemented בתנאים שאינם lytic, לחיות תאים דומים יותר אנדוגני המצב וכי מאפשרות מעקב אחר שינויים ברמות המחנה. שלישית, זמן יחסית קצר יותר נדרש לבצע פעולת השירות בזמן אמת. שיטה נוספת ניתוח תפוקה גבוהה של הפונקציה OR, אשר מסתמך על ביטוי גנים לוציפראז כתב, זקוק h 4 נוספים לאחר גירוי הריח כדי להשלים ניסוי. במקרים מסוימים, מרווח זמן דגירה ריח ממושך עלול לגרום רעילות odorant פוטנציאלית לתאים, אשר הביאו להקלה באופן יעיל תחת חשיפה ארעית. בנוסף, בניסויים יותר מתמיד, הסיכוי לזיהום של השכן בארות על-ידי volatilization כאשר משתמשים odorants שונים ו/או ריכוזים שונים של odorant אותו באותה הצלחת גם הוגדלה. זיהוי מיידי בעקבות תוספת ריח הופך וזמינותו המחנה בזמן אמת פרדיגמה מהיר ואמין.
המגבלות של המחנה בזמן אמת assay למדידת או הפעלה היא כדלקמן. ראשית, שלנו assay במבחנה מבוסס על קו תא HEK293T, נגזר אשר חסרה הרבה מולקולות אנדוגני של יליד נוירונים סנסוריים חוש הריח. יתר על כן, חלבונים מסיסים המרות אנזימטי המתרחשים הליחה האף עשוי להיקשר עם odorants ו/או להשפיע אור אהדה odorants. לכן, הפעלה במערכת heterologous עשוי להיות שונה מהמצב ויוו מבחינת רגישות וטיונינג ריח. שנית, זיהוי ORs עבור odorant נתון דורש בכל הרפרטואר או לפחות חלק מין הנתון. ORs הם משפחה גדולה של GPCRs והמספרים של חלבונים או בן אנוש והם העכבר גדול מאוד4,5,41. זמן רב ומאמץ עשויים להיות מעורבים בשיבוט כל הרפרטואר או עניין. שלישית, למרות שהמערכת ביטוי heterologous או כולל או שינויים רצף (כגון התג-Rho) וחלק החלבונים המפתח או אביזר (כגון RTP1S ו M3R), אנחנו חושדים כי לא כל ORs מתבטאים באופן פונקציונלי על קרום התא של נגזר HEK293T תאים. לכן, העדר תגובות ליישום מסוים odorant במבחנה לא בהכרח שולל או תגובה ויוו, עקב העובדה כי כמה ORs יכול להיות ביטוי על פני השטח תא לקוי ולא הצלחתי לזהות ליגנדים שלהם. לכן, בכל פעם מחנה ניתן בזמן אמת אמור לשמש בשילוב עם שאר מבחני במבחנה , ויוו כדי להשיג תוצאות משכנע יותר.
מספר שלבים קריטיים צריך תינתן תשומת לב נוספת במהלך וזמינותו המחנה בזמן אמת. ראשית, לניסויים מעורבים הפריה חוץ גופית באופן כללי, הטמפרטורה היא גורם מפתח זה משפיע על התוצאה של הניסוי כמו עליות בטמפרטורת להקטין את רמות המושרה הבזליים של פלט אור ולהגדיל יורדת הטמפרטורה פלט אור. לכן, equilibrating מראש את צלחות טמפרטורת ההפעלה מצב יציב של instrument לפני odorant תוספת נחוצה למנוע ההשפעה על תוצאות הנגרמת על ידי שינויי טמפרטורה. שנית, ריכוזי הכימית המצע assay המחנה בזמן אמת צריך להיות מותאם על פי המצב האמיתי. כאשר לומינסנציה הבזליים מצליח להגיע לסף זיהוי הנמוך של הקורא צלחת chemiluminescence, שצריך לשקול הגדלת ריכוז המצע כדי להגדיל את האות. בסופו של דבר, למרות היותו קו תא חסיד, תאים Hana3A עלולה לנתק במהלך הניסוי. כאשר כ רפה בעברית או הוספה של המדיום, הצבת את הטיפים פיפטה לצד הבאר באפשרותך למזער הפרעה של טפט התא. חשוב גם צלחת התאים בצפיפות מתאימה ואחידה להימנע overgrowing תאים צפופים. נקודות של תאים נוטים לקלף במהלך השינוי של המדיום.
בנוסף לזיהוי OR(s) עבור odorant עניין, וזמינותו המחנה בזמן אמת יכול לשמש גם עבור ליגנדים cognate עבור או נתון מסך כאשר ספריות של כימיקלים הינם זמינים. לבסוף, כאשר סוגי תאים המתאימים ותנאים תרביות תאים משמשים, וזמינותו עשוי גם לאפשר איתור של הפעלת GPCR overexpressed או אנדוגני ונותנים תלוי בריכוז-תגובת עקומות אגוניסטים והן היריבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי הסינית הלאומית למדע (31070972), מדע טכנולוגיה הנציבות של שנגחאי העירייה (16ZR1418300), תוכנית חדשנית מחקר צוות של שנגחאי העירוני ועדת החינוך, שנגחאי המזרחי המלומד התוכנית (J50201), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (2012CB910401).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Gibco | 10099-141 | |
| GloSensor cAMP reagent | Promega | E1290 | |
| pGloSensor-20F cAMP plasmid | Promega | E1171 | |
| Hana3A cells | available from authors upon request | ||
| HBSS, without calcium or magnesium | GIBCO | 14175095 | |
| HEPES | Hyclone | SH30237 | |
| Lipofectamine2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| M3R plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| MEM, with EBSS and L-glutamine | Hyclone | SH30024 | |
| Muscone | Santa Cruz | sc-200528 | |
| Musk tibetene | Sigma-Aldrich | S359165 | |
| OR plasmids | cloned with a Rho-tag into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| PBS, without calcium or magnesium | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Plasmid miniprep kit | Tiangen | DP103-03 | |
| Puromycin | Sigma | P8833 | |
| RTP1S plasmid | cloned into a mammalian expression vector such as pCI | ||
| Trypsin-EDTA | Hyclone | SH30236 | |
| 0.2-mL PCR tube | Axygen | PCR-02-C | |
| 1.5-mL Eppendorf tube | Eppendorf | ||
| 15-mL 17 mm x 120 mm conical tube | BD Falcon | 352096 | |
| 8-well and/or 12-well multichannel pipetman | Eppendorf | ||
| 96-well flat-bottomed white cell culture plate | Greiner | 655098 | |
| 100 mm x 20 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| Class II biological safety cabinet with laminar flow | |||
| Cell culture incubator, with 5% CO2 | |||
| Centrifuge, with swinging bucket rotor for 15-ml conical tubes | |||
| Infinite F200 plate reader | Tecan | ||
| Phase-contrast microscope with x10 and x20 objectives | |||
| Spectrophotometer | |||
| Sterile reagent reservoirs for multichannel distribution | |||
| Sterile paper towel |
References
- Malakoff, D.
- Zippel, H. P. The ecology of vertebrate olfaction: D.M. Stoddart. Chapman and Hall, Andover, Great Britain, 1980. £15.00, 234 pp. ISBN 0-412-21820-8. Behav Processes. 7 (2), 198-199 (1982).
- Dryer, L., Berghard, A. Odorant receptors: a plethora of G-protein-coupled receptors. Trends Pharmacol Sci. 20 (10), 413-417 (1999).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nat Neurosci. 5 (2), 124-133 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome Res. 11 (5), 685-702 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat Rev Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Reed, R. R. After the holy grail: establishing a molecular basis for Mammalian olfaction. Cell. 116 (2), 329-336 (2004).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- McClintock, T. S., et al. In vivo identification of eugenol-responsive and muscone-responsive mouse odorant receptors. J Neurosci. 34 (47), 15669-15678 (2014).
- Trimmer, C., Snyder, L. L., Mainland, J. D. High-throughput analysis of mammalian olfactory receptors: measurement of receptor activation via luciferase activity. J. Vis. Exp. (88), e51640 (2014).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Sci Signal. 2 (60), ra9 (2009).
- Jiang, Y., et al. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors for odors in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1446-1454 (2015).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Kajiya, K., et al. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. J Neurosci. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- von der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Nat Neurosci. 18 (10), 1455-1463 (2015).
- D'Hulst, C., et al. MouSensor: A Versatile Genetic Platform to Create Super Sniffer Mice for Studying Human Odor Coding. Cell Rep. 16 (4), 1115-1125 (2016).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic reticulum retention, degradation, and aggregation of olfactory G-protein coupled receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain Res Mol Brain Res. 48 (2), 270-278 (1997).
- Krautwurst, D., Yau, K. W., Reed, R. R. Identification of ligands for olfactory receptors by functional expression of a receptor library. Cell. 95 (7), 917-926 (1998).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. J Biol Chem. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Sci Signal. 4 (155), ra1 (2011).
- Durocher, Y., et al. A reporter gene assay for high-throughput screening of G-protein-coupled receptors stably or transiently expressed in HEK293 EBNA cells grown in suspension culture. Anal Biochem. 284 (2), 316-326 (2000).
- Liberles, S. D., Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature. 442 (7103), 645-650 (2006).
- Saraiva, L. R., et al. Combinatorial effects of odorants on mouse behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (23), E3300-E3306 (2016).
- Nara, K., Saraiva, L. R., Ye, X., Buck, L. B. A large-scale analysis of odor coding in the olfactory epithelium. J Neurosci. 31 (25), 9179-9191 (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Fan, F., et al. Novel genetically encoded biosensors using firefly luciferase. ACS Chem Biol. 3 (6), 346-351 (2008).
- Fan, B. F., Wood, K. V. Live-Cell Luminescent Assays for GPCR Studies: Combination of Sensitive Detection and Real-Time Analysis Expands Applications. Genetic Engineering & Biotechnology News. 29, 30-31 (2009).
- Geithe, C., Andersen, G., Malki, A., Krautwurst, D. A Butter Aroma Recombinate Activates Human Class-I Odorant Receptors. J Agric Food Chem. 63 (43), 9410-9420 (2015).
- Noe, F., et al. OR2M3: A Highly Specific and Narrowly Tuned Human Odorant Receptor for the Sensitive Detection of Onion Key Food Odorant 3-Mercapto-2-methylpentan-1-ol. Chem Senses. 42 (3), 195-210 (2016).
- Geithe, C., Noe, F., Kreissl, J., Krautwurst, D. The broadly tuned odorant receptor OR1A1 is highly selective for 3-methyl-2,4-nonanedione, a key food odorant in aged wines, tea, and other foods. Chem Senses. 42 (3), 181-193 (2016).
- Duan, X., et al. Crucial role of copper in detection of metal-coordinating odorants. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (9), 3492-3497 (2012).
- Li, S., et al. Smelling Sulfur: Copper and Silver Regulate the Response of Human Odorant Receptor OR2T11 to Low-Molecular-Weight Thiols. J Am Chem Soc. , (2016).
- Wu, L., Pan, Y., Chen, G. Q., Matsunami, H., Zhuang, H. Receptor-transporting protein 1 short (RTP1S) mediates translocation and activation of odorant receptors by acting through multiple steps. J Biol Chem. 287 (26), 22287-22294 (2012).
- Shirasu, M., et al. Olfactory receptor and neural pathway responsible for highly selective sensing of musk odors. Neuron. 81 (1), 165-178 (2014).
- Block, E., et al.
- Sato-Akuhara, N., et al. Ligand Specificity and Evolution of Mammalian Musk Odor Receptors: Effect of Single Receptor Deletion on Odor Detection. J Neurosci. 36 (16), 4482-4491 (2016).
- Gane, S., et al. Molecular vibration-sensing component in human olfaction. PLoS One. 8 (1), e55780 (2013).
- Young, J. M., et al. Different evolutionary processes shaped the mouse and human olfactory receptor gene families. Hum Mol Genet. 11 (5), 535-546 (2002).
