Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.
Abstract
Genoom-wide mapping van eiwit-DNA interacties is van cruciaal belang voor het begrijpen van genregulatie, chromatin remodeling en andere chromatin-residente processen. Formaldehyde verknoping gevolgd door chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (X-ChIP-seq) is gebruikt om veel waardevolle inzicht in genoombiologie te verkrijgen. X-ChIP-seq heeft echter opvallende beperkingen verbonden aan crosslinking en sonication. Inheemse ChIP vermijdt deze nadelen door crosslinking weg te nemen, maar resulteert vaak in slecht herstel van chromatine gebonden eiwitten. Bovendien zijn alle ChIP-gebaseerde methoden onderworpen aan antilichaamkwaliteit overwegingen. Enzymatische methoden voor het mappen van eiwit-DNA-interacties, waarbij fusie van een eiwit van belang is voor een DNA-modificerend enzym, is ook gebruikt om eiwit-DNA-interacties te coderen. We hebben onlangs een dergelijke methode gecombineerd, chromatine endogene cleavage (ChEC), met high-throughput sequencing als ChEC-seq. ChEC-seq berust op fusie van een chromatine-assocGeïncentreerd eiwit van belang voor micrococculaire nuclease (MNase) om gerichte DNA-splitsing te genereren in aanwezigheid van calcium in levende cellen. ChEC-seq is niet gebaseerd op immunoprecipitatie en vermijdt zo mogelijke problemen met crosslinking, sonicatie, chromatinoplossing en antilichaamkwaliteit, terwijl het een hoge resolutie mapping biedt met minimaal achtergrondsignaal. We zijn van mening dat ChEC-seq een krachtige tegenpartij bij ChIP zal zijn, waardoor een onafhankelijke methode wordt verkregen om beide bevindingen van ChIP-seq te valideren en nieuwe inzichten te ontdekken in genomische regulering.
Introduction
Mapping van de bindingsplaatsen van transcriptiefactoren (TF's), chromatine remodelers en andere chromatin-geassocieerde regulerende factoren is de sleutel tot het begrijpen van alle chromatin gebaseerde processen. Terwijl chromatine immunoprecipitatie en high-throughput sequencing (ChIP-seq) benaderingen zijn gebruikt om veel belangrijke inzichten in genoombiologie te krijgen, hebben ze opmerkelijke beperkingen. Wij hebben onlangs een alternatieve methode geïntroduceerd, genaamd chromatin endogene splitsing en high-throughput sequencing (ChEC-seq) 1 , om deze nadelen te omzeilen.
ChIP-seq wordt meestal uitgevoerd met een initiële formaldehyde verknopingstap (X-ChIP-seq) om eiwit-DNA-interacties te behouden. Een aantal recente studies hebben echter aangetoond dat X-ChIP-seq transiënte of niet-specifieke eiwit-DNA-interacties vastlegt 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , die aanleiding geven tot valse positieve bindingsplaatsen. Bovendien, sonicatie, die gewoonlijk wordt gebruikt om fragmentin te fragmenteren in X-ChIP-seq experimenten, bij voorkeur schaarstreken van open chromatine, wat resulteert in voorspannen herstel van fragmenten uit deze gebieden 9 , 10 . Sonicatie levert ook een heterogeen mengsel van fragmentlengtes op, waardoor de bindingsplaatsresolutie uiteindelijk wordt beperkt, hoewel de toevoeging van een exonuclease-verteringstap de resolutie 11 , 12 aanzienlijk kan verbeteren. Inheemse ChIP-methoden zoals bezette gebieden van genen uit affiniteitszuiverde natuurlijk geïsoleerde chromatine (ORGANISCHE) 13 gebruiken geen verknoping en fragmentchromatine met micrococculaire nuclease (MNase), waardoor potentiële vooroordelen worden geassocieerd met formaldehydeverknoping en sonicatie. Echter,De oplosbaarheid van veel chromatine gebonden eiwitten onder de relatief milde omstandigheden die nodig zijn voor natieve chromatine extractie is slecht, wat mogelijk leidt tot verminderde dynamische bereik en / of valse negatieven 14 .
Hoewel verschillende iteraties van ChIP-seq meestal worden gebruikt voor genoom-brede mapping van eiwit-DNA-interacties, zijn ook verschillende mappingstechnieken gebaseerd op fusie van eiwitten van belang voor diverse DNA-modificerende enzymen geïmplementeerd. Een dergelijke benadering is DNA-adenine-methyltransferase-identificatie (DamID) 15 , waarbij een chromatine-bindend eiwit van belang genetisch gesmolten is met Dam en deze fusie wordt uitgedrukt in cellen of dieren, resulterend in methylering van GATC sequenties proximaal voor bindingsplaatsen voor het eiwit. DamID is voordelig doordat het niet staat op immunoprecipitatie en vermijdt dus verknoping, antilichamen of chromatinoplosbaarheid. Het wordt ook in vivo uitgevoerd. Echter, De resolutie van DamID is beperkt tot de kilobase-schaal en de methyleringsactiviteit van het Dam-fusie-eiwit is constitutief. Een tweede methode op basis van enzymatische fusie is Calling Card-seq 16 , waarbij fusie van een factor van belang is voor een transposase, waarbij site-specifieke integratie van transposons wordt aangestuurd. Net als DamID is Calling Card-seq niet gebaseerd op immunoprecipitatie en heeft derhalve dezelfde voordelen, met als extra voordeel van een verhoogde resolutie. Calling Card-seq kan echter worden beperkt door sequentieverzettingen van transposases en is ook afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen nabij transposon-insertieplaatsen.
Een derde enzymatische fusie methode, ontwikkeld in het Laemmli lab, is chromatine endogene splitsing (ChEC) 17 . In ChEC wordt een fusie tussen een chromatine geassocieerd eiwit en MNase uitgedrukt in cellen, en na calciumtoevoeging om MNase te activeren, wordt DNA proximaal gesplitst aan bindingsplaatsen voor de getagdeFactor ( figuur 1 ). In combinatie met Southern Blotting is ChEC gebruikt om chromatinstructuur en eiwitbinding op een aantal individuele loci in gist 17 , 18 te karakteriseren en is gecombineerd met microarrayanalyse met lage resolutie om de interactie van kernpompcomponenten met de gist te onderzoeken Genoom 19 . ChEC biedt voordelen die vergelijkbaar zijn met DamID en Calling Card-seq, en de resolutie is bijna enkelbasispaar wanneer geanalyseerd door primeruitbreiding 19 . ChEC is ook controleerbaar: robuuste DNA-splitsing door MNase hangt af van de toevoeging van millimolair calcium, zodat MNase inactief is bij de lage vrije calciumconcentraties waargenomen in levende gistcellen 20 .
Voorheen hebben we gepostuleerd dat het combineren van ChEC met high-throughput sequencing (ChEC-seq) high-resolution kaarten van TF bindingsplaatsen zou verschaffen. Inderdaad, ChEC-seq gegenereerde kaarten met hoge resolutie van de ontluikende gistregulatieve factoren (GRF's) Abf1, Rap1 en Reb1 over het genoom 1 . We hebben ook succesvol ChEC-seq toegepast op het modulaire Mediator-complex, een geconserveerde, essentiële, globale transcriptiecoactivator 21 , die de toepasbaarheid van ChEC-seq uitbreidt naar megadalton-complexen die niet direct contact met DNA hebben en moeilijk kunnen zijn om te plotten door ChIP- Gebaseerde methoden. ChEC-seq is een krachtige methode, zowel voor de onafhankelijke validatie van ChIP-seq-resultaten en het genereren van nieuwe inzichten in de regeling van chromatin-residente processen. Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol voor de implementatie van deze methode in ontluikende gist.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben aangetoond dat ChEC diverse klassen gistproteïnen op chromatine kan plassen en anticiperen dat het in grote mate van toepassing zal zijn op verschillende families van TF's en andere chromatine-bindende factoren in gist. ChEC-seq is voordelig doordat het geen crosslinking, chromatinoplosbaarheid of antilichamen vereist. Zo vermijdt ChEC artefacten die mogelijk aanwezig zijn in X-ChIP-seq, zoals het hyper-ChIPable artefact 3 , 4 en native ChIP, zoal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Moustafa Saleh en Jay Tourigny voor kritische lezing van het manuscript en Steven Hahn en Steven Henikoff voor mentor en ondersteuning tijdens de ontwikkeling van ChEC-seq en de toepassing ervan op het Mediatorcomplex. SG wordt ondersteund door NIH subsidies R01GM053451 en R01GM075114 en GEZ wordt ondersteund door Indiana University startup funds.
Materials
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it’s good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
