Геномное картирование белково-ДНК-взаимодействий с ChEC-seq in<em> Разное</em
Summary
Мы описываем эндогенное расщепление хроматина в сочетании с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq), хромопатическим иммунопреципитацией (ChIP) -ортогональным методом для картирования сайтов связывания с белками генома с гибридными белками с микрококковой нуклеазой (MNase).
Abstract
Геномное картирование взаимодействия белок-ДНК имеет решающее значение для понимания регуляции генов, ремоделирования хроматина и других хроматиновых резидентных процессов. Сформирование формальдегида с последующей иммунопреципитацией хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (X-ChIP-seq) было использовано для получения многих ценных сведений о биологии генома. Однако X-ChIP-seq имеет значительные ограничения, связанные с сшиванием и ультразвуком. Родной ChIP избегает этих недостатков, исключая сшивание, но часто приводит к плохому восстановлению связанных с хроматином белков. Кроме того, все методы на основе ChIP подвержены соображениям качества антител. Для картирования белково-ДНК-взаимодействий также использовались ферментативные методы картирования белково-ДНК-взаимодействий, которые включают слияние белка, представляющего интерес для модифицирующего ДНК фермента. Недавно мы объединили один такой метод – хроническое эндогенное расщепление (ChEC), с высокопроизводительным секвенированием как ChEC-seq. ChEC-seq полагается на слияние хроматина-ассоциированногоКоторый представляет интерес для микрококковой нуклеазы (МНКазы) для получения целенаправленного расщепления ДНК в присутствии кальция в живых клетках. ChEC-seq не основан на иммунопреципитации и поэтому обходит потенциальные проблемы с сшиванием, ультразвуком, солюбилизацией хроматина и качеством антител, обеспечивая при этом отображение высокого разрешения с минимальным фоновым сигналом. Мы предполагаем, что ChEC-seq станет мощным партнером ChIP, предоставляя независимые средства, позволяющие как проверять результаты ChIP-seq, так и открывать новые представления о геномном регулировании.
Introduction
Сопоставление сайтов связывания факторов транскрипции (ТФ), ремоделиров хроматина и других связанных с хроматином регуляторных факторов является ключом к пониманию всех процессов на основе хроматина. В то время как подходы хромотанового иммунопреципитации и высокопроизводительного секвенирования (ChIP-seq) были использованы для получения многих важных сведений о биологии генома, они имеют значительные ограничения. Недавно мы представили альтернативный метод, называемый эндогенным расщеплением хроматина и секвенированием с высокой пропускной способностью (ChEC-seq) 1 , чтобы обойти эти недостатки.
ChIP-seq чаще всего проводят с начальной стадией поперечной сшивки формальдегида (X-ChIP-seq) для сохранения взаимодействия белок-ДНК. Однако в ряде недавних исследований было показано, что X-ChIP-seq захватывает переходные или неспецифические белково-ДНК-взаимодействия 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , что приводит к появлению ложноположительных сайтов связывания. Кроме того, обработка ультразвуком, обычно используемая для фрагментации хроматина в экспериментах X-ChIP-seq, предпочтительно сдвигает области открытого хроматина, что приводит к необъективному извлечению фрагментов из этих областей 9 , 10 . Ультразвук также дает гетерогенную смесь длин фрагментов, в конечном счете ограничивая разрешение сайта-сайта, хотя добавление стадии экстрагирования экзонуклеазой может значительно улучшить разрешение 11 , 12 . Нативные методы ChIP, такие как оккупированные области геномов из очищенного от аффинности естественно выделенного хроматина (ORGANIC) 13 , не используют сшивание и фрагмент хроматина с микрококковой нуклеазой (MNase), уменьшая потенциальные смещения, связанные с сшиванием формальдегида и ультразвуком. Однако,Растворимость многих белков, связанных хроматинами, в относительно мягких условиях, необходимых для естественной экстракции хроматина, является плохим, что потенциально приводит к уменьшению динамического диапазона и / или ложных негативов 14 .
В то время как различные итерации ChIP-seq наиболее часто используются для картирования белок-ДНК в геноме, были также реализованы несколько методов картирования, основанных на слиянии белков, представляющих интерес для различных модифицирующих ДНК ферментов. Одним из таких подходов является идентификация ДНК-аденин-метилтрансферазы ДНК (DamID) 15 , где интересующий хроматин белок, представляющий интерес, генетически слит с плотиной, и этот синтез экспрессируется в клетках или животных, что приводит к метилированию последовательностей GATC, близких к сайтам связывания белка. DamID выгодно тем, что он не полагается на иммунопреципитацию и поэтому избегает сшивания, антител или солюбилизации хроматина. Он также выполняется in vivo . Однако, Разрешение DamID ограничено шкалой килобаз, и метилирующая активность слитого белка плотины является конститутивной. Второй способ, основанный на ферментативном слиянии, – это Calling Card-seq 16 , в котором используется слияние интересующего фактора с транспозазой, направляя специфическую для сайта интеграцию транспозонов. Подобно DamID, Calling Card-seq не основан на иммунопреципитации и, следовательно, имеет схожие преимущества, с дополнительным преимуществом повышенного разрешения. Однако Call-Card-seq может быть ограничена последовательными смещениями транспозаз и также зависит от наличия сайтов рестрикции, близких к сайтам вставки транспозонов.
Третий метод ферментативного слияния, разработанный в лаборатории Laemmli, представляет собой эндогенное расщепление хроматина (ChEC) 17 . В ChEC слияние между хроматин-ассоциированным белком и MNase экспрессируется в клетках, а после добавления кальция для активации MNase ДНК расщепляется проксимально к сайтам связывания для меченыхФактора ( рис. 1 ). В сочетании с Саузерн-блоттингом ChEC использовался для характеристики структуры хроматина и связывания белка в ряде отдельных локусов в дрожжах 17 , 18 и был объединен с микроматричным анализом с низким разрешением для зондирования взаимодействия компонентов ядерных пор с дрожжами Геном 19 . ChEC предлагает преимущества, подобные DamID и Calling Card-seq, и его разрешение почти однопалубной пары при анализе с помощью расширения 19 праймера. ChEC также контролируема: надежное расщепление ДНК с помощью MNase зависит от добавления миллимолярного кальция, гарантируя, что MNase неактивен при низких концентрациях свободного кальция, наблюдаемых в живых дрожжевых клетках 20 .
Ранее мы предположили, что объединение ChEC с высокопроизводительным секвенированием (ChEC-seq) обеспечит карты с высоким разрешением сайтов привязки TF. Действительно, ChEC-seq генерирует карты высокого разрешения почкообразующих общих регуляторных факторов (GRF) Abf1, Rap1 и Reb1 в геноме 1 . Мы также успешно применили ChEC-seq к модульному медиаторному комплексу, сохраняющемуся, существенному глобальному транскрипционному коактиватору 21 , расширяющему применимость ChEC-seq к комплексам размером в мегадальтон, которые напрямую не связаны с ДНК и могут быть трудно отображены ChIP- Основанные методы. ChEC-seq является мощным методом как для независимой проверки результатов ChIP-seq, так и для генерации новых представлений о регулировании хроматин-резидентных процессов. Здесь мы представляем пошаговый протокол для реализации этого метода в почкодоносных дрожжах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы показали, что ChEC может отображать различные типы дрожжевых белков на хроматине и предвидеть, что он будет широко применяться к различным семействам TF и другим хроматин-связывающим факторам у дрожжей. ChEC-seq выгоден тем, что он не требует сшивки, солюбилизации хроматина или антител….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мустафу Салеха и Джей Туиньи за критическое чтение рукописи и Стивена Хана и Стивена Хеникова за наставничество и поддержку во время разработки ChEC-seq и его применения к медиаторскому комплексу. SG поддерживается грантами NIH R01GM053451 и R01GM075114, а GEZ поддерживается фондами запуска Университета штата Индиана.
Materials
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it’s good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
