ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em> Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.
Abstract
Genom çapında protein-DNA etkileşim haritalama, gen regülasyonunu, kromatin yeniden şekillendirmeyi ve diğer kromatin yerleşik süreçleri anlamak için kritiktir. Genom biyolojisine birçok değerli bilgi kazandırmak için kromatin immüno çökeltme ve ardından yüksek verimli sekanslama (X-ChIP-seq) ile yapılan formaldehit çapraz bağlama işlemi kullanılmıştır. Bununla birlikte, X-ChIP-seq'in çapraz bağlama ve sonikasyon ile bağlantılı önemli sınırlamalar vardır. Yerli ChIP, bu dezavantajları çapraz bağlama yapılmadan çıkarmaktan kaçınır, ancak sıklıkla kromatin bağlı proteinlerin iyileşmesinde zayıflamaya neden olur. Buna ek olarak, tüm ChIP tabanlı yöntemler antikor kalitesi hususlarına tabidir. Protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için ilgi konusu bir proteinin bir DNA modifiye eden enzime kaynaştırılmasını içeren enzimatik yöntemler protein-DNA etkileşimlerini haritalamak için de kullanılmıştır. Son zamanlarda ChEC-seq olarak yüksek verimli sekanslama ile böyle bir metot olan kromatin endojen bölünmeyi (ChEC) kombine ettik. ChEC-seq, bir kromatin-assokun kaynaşmasına dayanıyorCanlı hücrelerde kalsiyum varlığında hedeflenmiş DNA bölünmesi üretmek için mikrokakal nükleaz (MNase) ile ilgilidir. ChEC-seq, bağışıklık çökmesine dayalı değildir ve çapraz bağlama, sonikasyon, kromatin çözünürlüğü ve antikor kalitesi ile potansiyel endişeleri ortadan kaldırırken, minimum arka plan sinyali ile yüksek çözünürlüklü haritalama sağlar. ChEC-seq'in ChIP için güçlü bir muadil olacağını ve ChIP-seq bulgularını doğrulamak ve genomik düzenlemeye yeni bakış açıları keşfetmek için bağımsız bir araç sağlayacağını düşünüyoruz.
Introduction
Transkripsiyon faktörlerinin (TF'ler), kromatin yeniden biçimlendiricilerin ve diğer kromatin ile ilişkili düzenleyici faktörlerin bağlanma yerlerinin haritalandırılması, tüm kromatin esaslı işlemleri anlamak için anahtardır. Kromatin immüno çökeltme ve yüksek verimli sekanslama (ChIP-seq) yaklaşımları, genom biyolojisine ilişkin birçok önemli bilgiler edinmek için kullanılmış olsa da, önemli sınırlamalara sahiptir. Kısa süre önce, bu dezavantajları ortadan kaldırmak için kromatin endojen bölünme ve yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) 1 olarak adlandırılan alternatif bir yöntem sunduk.
ChIP-seq sıklıkla protein-DNA etkileşimlerini korumak için bir başlangıç formaldehid çapraz bağlama basamağı (X-ChIP-seq) ile gerçekleştirilir. Bununla birlikte, son zamanlarda yapılan bir dizi çalışma, X-ChIP-seq'in geçici veya nonspesifik protein-DNA etkileşimleri 2 , 3 , 4 , 5 <6 , 7 , 8 , yanlış pozitif bağlanma yerlerine neden olur. Ek olarak, X-ChIP-seq deneylerinde kromatin parçalanmak için yaygın olarak kullanılan sonikasyon, açık kromatin bölgelerini keser ve bu bölgelerdeki fragmanların önyargılı olarak geri kazanılmasına neden olur 9 , 10 . Sonikasyon ayrıca, bir eksonukleç sindirim adımı eklenmesiyle 11 , 12 çözünürlüğünü büyük ölçüde artırabilecek olsa da, sonuç olarak bağlanma yeri çözünürlüğünü sınırlayan bir parçacık uzunluğunun heterojen bir karışımını üretir. Afinite ile saflaştırılmış doğal olarak izole edilmiş kromatin (ORGANIC) 13 gen alanlarının işgal edilmiş bölgeleri gibi yerli ChIP yöntemleri, formaldehit çapraz bağlanma ve sonikasyon ile ilişkili potansiyel önyargıları hafifleterek mikrokakal nükleazla (MNase) çapraz bağlama ve fragman kromatin kullanmazlar. Ancak,Doğal kromatin ekstraksiyonu için gerekli nispeten ılımlı koşullardaki birçok kromatin bağlı proteininin çözünürlüğü zayıf olup, potansiyel olarak dinamik aralık ve / veya yanlış negatiflerin azalmasına neden olur14.
ChIP-seq'ün çeşitli yinelemeleri, genom çapında protein-DNA etkileşimlerinin haritalanması için en çok kullanılan yöntem olmasına rağmen, ilgilenilen proteinlerin çeşitli DNA modifıye eden enzimlere kaynaşmasına dayanan çeşitli haritalama teknikleri de uygulanmıştır. Bu tür bir yaklaşım DNA'nın adenine metiltransferaz tanımlaması (DamID) 15'dir, burada ilgilenilen bir kromatin-bağlayıcı protein Genetik olarak Baraja kaynaştırılır ve bu füzyon, hücrelerde veya hayvanlarda eksprese edilir ve böylece GATC dizilerinin protein için bağlanma bölgelerine yakın metillenmesine yol açar. DamID, immüno çökeltiye dayanmadığı ve dolayısıyla çapraz bağlanma, antikorlar veya kromatin çözünürlüğünden kaçınması bakımından avantajlıdır. Aynı zamanda in vivo da gerçekleştirilir. ancak, DamID'in çözünürlüğü kilobaz ölçeği ile sınırlıdır ve Baraj füzyon proteininin metilasyon aktivitesi yapıcıdır. Enzimatik füzyona dayanan ikinci bir yöntem Call-Card-seq 16'dır ; bu, bir transpozaza bir ilgi faktörünün füzyonunu uygular ve transposonların sahaya özgü entegrasyonunu yönlendirir. DamID gibi, Calling Card-seq, immüno çöktürmeye dayalı değildir ve dolayısıyla artan çözünürlüğün ilave yararı ile benzer avantajlara sahiptir. Bununla birlikte, Calling Card-seq, transpozazların sekans yanlılıkları ile sınırlanabilir ve transposon ekleme bölgelerine yakın kısıtlama alanlarının varlığına da bağımlıdır.
Laemmli laboratuvarında geliştirilen üçüncü bir enzimatik füzyon yöntemi, kromatin endojen bölünme (ChEC) 17 dir . ChEC'de, bir kromatin ile ilişkili protein ve MNase arasındaki bir kaynaşma, hücrelerde eksprese edilir ve MNase'i aktive etmek için kalsiyum ilave edildikten sonra, DNA, etiketlenen bağlanma yerlerine proksimal olarak bölünürFaktörü ( Şekil 1 ). Güney blot ile bağlantılı olarak, ChEC maya 17 , 18'de bir dizi bireysel lokusta kromatin yapısını ve protein bağlanmasını karakterize etmek için kullanılmıştır ve nükleer gözenek bileşenlerinin maya ile etkileşimini araştırmak için düşük çözünürlüklü mikro-dizi analizi ile birleştirilmiştir Genom 19 . ChEC, DamID ve Calling Card-seq'ye benzer fayda sunar ve çözünürlüğü, primer uzantısı 19 ile analiz edildiğinde neredeyse tek-bazlı çifti oluşturmaktadır. ChEC de kontrol edilebilir: MNase tarafından sağlam DNA bölünmesi, canlı maya hücrelerinde gözlemlenen düşük serbest kalsiyum konsantrasyonlarında MNase'in inaktif olmasını sağlayan, milimolar kalsiyum ilavesi ile ilgilidir.
Daha önce, ChEC'yi yüksek verimli sıralama (ChEC-seq) ile birleştirmenin, TF bağlama alanlarının yüksek çözünürlüklü haritalarını sağlayacağını varsaydık. Nitekim ChEC-seq, genom boyunca tomurcuklanan maya genel düzenleyici faktörlerin (GRF'ler) Abf1, Rap1 ve Reb1'in yüksek çözünürlüklü haritalarını üretti. ChEC-seq'u, doğrudan DNA'ya temas etmeyen ve ChIP-seq ile eşlenmeyen megadalton-boyutlu komplekslere uygulanabilirliğini genişleten, korunmuş, önemli bir global transkripsiyonel koaktivatör 21 olan modüler Mediator kompleksine başarıyla uyguladık. Tabanlı yöntemler. ChEC-seq, ChIP-seq sonuçlarının bağımsız olarak doğrulanması ve kromatin yerleşik süreçlerin düzenlenmesine ilişkin yeni anlayışların oluşturulması için güçlü bir yöntemdir. Burada, mayalanma mayasında bu yöntemin uygulanması için bir adım adım protokol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChEC'in kromatin üzerinde çeşitli maya protein sınıflarını haritalayabileceğini ve bunun mayada farklı TF'ler ailelerine ve diğer kromatin bağlayıcı faktörlere uygulanabileceğini öngörüyoruz. ChEC-seq, çapraz bağlanma, kromatin çözünürlüğü veya antikorları gerektirmediğinden avantajlıdır. Dolayısıyla, ChEC, X-ChIP-seq'de potansiyel olarak mevcut hâllerde bulunan hiper-ChIPable eser 3 , 4 ve yerli ChIP gibi, eksik pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Moustafa Saleh ve Jay Tourigny'ye el yazması ile Steven Hahn ve Steven Henikoff'un eleştirel okumaları için ChEC-seq'in gelişimi boyunca rehberlik ve destek için ve arabulucu kompleksine uygulanmasından dolayı teşekkür ediyoruz. SG, NIH bağışları R01GM053451 ve R01GM075114 tarafından desteklenmektedir ve GEZ, Indiana Üniversitesi başlangıç fonlarıyla desteklenmektedir.
Materials
| dNTPs | NEB | N0447 | |
| Q5 high-fidelity DNA polymerase | NEB | M0491L | Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification. |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder | ThermoFisher Scientific | 10488085 | |
| Taq DNA polymerase | NEB | M0273L | |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+. |
| PMSF | ACROS Organics | AC215740010 | |
| Digitonin, High Purity | EMD Millipore | 300410-250MG | Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing. |
| Proteinase K, 20 mg/mL | Invitrogen | 25530049 | |
| RNase A, 10 mg/mL | ThermoFisher Scientific | EN0531 | |
| Ampure XP beads | Beckman Coulter | A63880 | Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24). |
| MagneSphere magnetic rack | Promega | Z5342 |
References
- Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo. Nat Commun. 6, 8733 (2015).
- Chen, J., et al. Single-Molecule Dynamics of Enhanceosome Assembly in Embryonic Stem Cells. Cell. 156 (6), 1274-1285 (2014).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Park, D., Lee, Y., Bhupindersingh, G., Iyer, V. R. Widespread Misinterpretable ChIP-seq Bias in Yeast. PLoS ONE. 8 (12), 83506 (2013).
- Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. Active promoters give rise to false positive ‘Phantom Peaks’ in ChIP-seq experiments. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Krebs, W., et al. Optimization of transcription factor binding map accuracy utilizing knockout-mouse models. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13051-13060 (2014).
- Paul, E., Zhu, Z. I., Landsman, D., Morse, R. H. Genome-Wide Association of Mediator and RNA Polymerase II in Wild-Type and Mediator Mutant Yeast. Mol Cell Biol. 35 (1), 331-342 (2015).
- Worsley Hunt, R., Wasserman, W. W. Non-targeted transcription factors motifs are a systemic component of ChIP-seq datasets. Genome Biol. 15 (7), 412 (2014).
- Vega, V. B., Cheung, E., Palanisamy, N., Sung, W. -. K. Inherent Signals in Sequencing-Based Chromatin-ImmunoPrecipitation Control Libraries. PLoS ONE. 4 (4), 5241 (2009).
- Teytelman, L., et al. Impact of Chromatin Structures on DNA Processing for Genomic Analyses. PLoS ONE. 4 (8), 6700 (2009).
- Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive Genome-wide Protein-DNA Interactions Detected at Single-Nucleotide Resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
- He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints. Nat Biotech. 33 (4), 395-401 (2015).
- Kasinathan, S., Orsi, G. A., Zentner, G. E., Ahmad, K., Henikoff, S. High-resolution mapping of transcription factor binding sites on native chromatin. Nat Methods. 11 (2), 203-209 (2014).
- Skene, P. J., Hernandez, A. E., Groudine, M., Henikoff, S. The nucleosomal barrier to promoter escape by RNA polymerase II is overcome by the chromatin remodeler Chd1. eLife. 3, 02042 (2014).
- Aughey, G. N., Southall, T. D. Dam it’s good! DamID profiling of protein-DNA interactions. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 5 (1), 25-37 (2016).
- Wang, H., Mayhew, D., Chen, X., Johnston, M., Mitra, R. D. Calling Cards enable multiplexed identification of the genomic targets of DNA-binding proteins. Genome Res. 21 (5), 748-755 (2011).
- Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. ChIC and ChEC: Genomic Mapping of Chromatin Proteins. Mol Cell. 16 (1), 147-157 (2004).
- Merz, K., et al. Actively transcribed rRNA genes in S. cerevisiae are organized in a specialized chromatin associated with the high-mobility group protein Hmo1 and are largely devoid of histone molecules. Genes Dev. 22 (9), 1190-1204 (2008).
- Schmid, M., et al. Nup-PI: The Nucleopore-Promoter Interaction of Genes in Yeast. Mol Cell. 21 (3), 379-391 (2006).
- Dunn, T., Gable, K., Beeler, T. Regulation of cellular Ca2+ by yeast vacuoles. J Biol Chem. 269 (10), 7273-7278 (1994).
- Grünberg, S., Henikoff, S., Hahn, S., Zentner, G. E. Mediator binding to UASs is broadly uncoupled from transcription and cooperative with TFIID recruitment to promoters. The EMBO Journal. 35 (22), 2435-2446 (2016).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).
- Orsi, G. A., Kasinathan, S., Zentner, G. E., Henikoff, S., Ahmad, K., Ausubel, F. M., et al. Mapping regulatory factors by immunoprecipitation from native chromatin. Current protocols in molecular biology. 110, 21-25 (2015).
- Heinz, S., et al. Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities. Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
- Kungulovski, G., et al. Application of histone modification-specific interaction domains as an alternative to antibodies. Genome Res. 24 (11), 1842-1853 (2014).
- Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells. Nat. Protocols. 2 (6), 1467-1478 (2007).
- Feeser, E. A., Wolberger, C. Structural and Functional Studies of the Rap1 C-Terminus Reveal Novel Separation-of-Function Mutants. J Mol Biol. 380 (3), 520-531 (2008).
- Neph, S., et al. An expansive human regulatory lexicon encoded in transcription factor footprints. Nature. 489 (7414), 83-90 (2012).
- Mountjoy, K. G., Kong, P. L., Taylor, J. A., Willard, D. H., Wilkison, W. O. Melanocortin receptor-mediated mobilization of intracellular free calcium in HEK293 cells. Physiol Genomics. 5 (1), 11-19 (2001).
- Seurin, D., Lombet, A., Babajko, S., Godeau, F., Ricort, J. -. M. Insulin-Like Growth Factor Binding Proteins Increase Intracellular Calcium Levels in Two Different Cell Lines. PLoS ONE. 8 (3), e59323 (2013).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging Calcium in Neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotech. 32 (4), 347-355 (2014).
- Filion, G. J., et al. Systematic Protein Location Mapping Reveals Five Principal Chromatin Types in Drosophila Cells. Cell. 143 (2), 212-224 (2010).
- van Bemmel, J. G., et al. A Network Model of the Molecular Organization of Chromatin in Drosophila. Mol Cell. 49 (4), 759-771 (2013).
- Izzo, A., et al. The Genomic Landscape of the Somatic Linker Histone Subtypes H1.1 to H1.5 in Human Cells. Cell Rep. 3 (6), 2142-2154 (2013).
