Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging
Summary
Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll für die in-Vivo Bildgebung der Netzhaut Maus mit hochauflösenden spektralen Bereich optische Kohärenztomographie (SD-OCT). Es konzentriert sich auf die retinalen Ganglienzellen (RGC) in der peripapillären Region mit mehreren scannen und Quantifizierung der beschriebenen Ansätze.
Abstract
Strukturelle Veränderungen in der Netzhaut sind gemeinsame Manifestationen von Augenkrankheiten. Optische Kohärenztomografie (OCT) ermöglicht die Identifikation in Vivo– schnell, wiederholt und mit einer hohen Auflösung. Dieses Protokoll beschreibt OCT-Bildgebung in der Netzhaut Maus als ein leistungsfähiges Werkzeug zur optische Neuropathien (OPN) zu studieren. Das OCT-System ist eine Interferometrie-basierte, nicht-invasive Alternative zur gemeinsamen post-mortem histologischen Untersuchungen. Freuen Sie sich auf eine schnelle und genaue Bewertung der Netzhautdicke, die Möglichkeit zum Nachverfolgen von Änderungen, wie z. B. Netzhaut dünner oder dicker. Wir präsentieren die bildgebenden Verfahren und Analyse am Beispiel der Opa1DelTTAG Mauslinie. Drei Arten von Scans angeboten, mit zwei Quantifizierungsmethoden: standard und hausgemachte Bremssättel. Letzteres ist am besten für den Einsatz auf der peripapillären Netzhaut bei radialen Scans; genauer gesagt wird, ist für die Analyse dünner Strukturen vorzuziehen. Alle hier beschriebenen Ansätze eignen sich für retinalen Ganglienzellen (RGC) aber sind leicht anpassbar an andere Zell-Populationen. Zusammenfassend, OCT ist in Maus-Modell Phänotypisierung effizient und hat das Potenzial für die verlässliche Bewertung therapeutischer Interventionen verwendet werden.
Introduction
OCT ist ein Diagnosetool, das erleichtert die Prüfung der retinalen Strukturen1, einschließlich des Sehnervenkopfes (ONH). Im Laufe der Jahre ein verlässlicher Indikator des Fortschreitens der Krankheit im Menschen2,3, sowie in Nagetieren4,5geworden. Interferometrie verwendet, um Schnittbilder der Netzhaut Schichten bei einer axialen Auflösung von 2 µm zu erstellen. Die innerste Schicht ist der retinalen Nervenfaserschicht Layer (RNFL), mit RGC Axone, gefolgt von der Ganglion Zellschicht (GCL), mit meist RGC Körper. Als nächstes ist die innere plexiformen Schicht (IPL), wo RGC Dendriten bipolare, Horizontal und amakrinen Zellen Axone treffen. Diese, zusammen mit horizontalen Zellen bilden die nukleare Innenschicht (INL), und ihre Vorsprünge mit Photorezeptor Axone in der äußeren plexiformen Schicht (OPL) verbinden. Dies wird gefolgt von der nuklearen Außenschicht (ONL) mit Photorezeptor Zellkörpern und ist von der Photorezeptor-Schicht durch die äußere begrenzende Membran (OLM), auch genannt das innere Segment/äußere Segment getrennt (IS / OS) Schicht. Schließlich sind die letzten beobachtbaren Schichten der Netzhaut Maus das retinale Pigmentepithel (RPE) und die Aderhaut (C). Die RNFL allein ist in der Regel zu dünn, um bei Mäusen gemessen werden; so ist die Analyse der RNFL/GCL stattdessen bevorzugt4,5. Eine weitere Möglichkeit ist die GC komplexe Schicht, die letztere neben dem IPL enthält, dadurch dicker und somit auch leichter zu messen am Okt.4scannt. Infolgedessen bieten Einblick in den pathologischen Status der Netzhaut, wie z. B. OCT in OPNs.
Alternativ wird die Dicke der Netzhaut Maus oft mit post-mortem Histologie analysiert. Jedoch können diese Technik Gesichter Einschränkungen in Bezug auf Gewebe Sammlung, Fixierung, schneiden, färben, Montage, etc. daher einige Mängel, wie subtil Dicke Veränderungen erkannt werden. Schließlich, da die gleiche Maus nicht auf einige Zeit getestet werden kann zeigt, die Anzahl der Tiere pro Studie stark erhöht, im Gegensatz zu für OCT. Alles in allem die nicht-Invasivität, hochauflösend, Möglichkeit zur Wiederholung, Zeitüberwachung in Zeit und Benutzerfreundlichkeit der OCT-Technologie machen es die Methode der Wahl in Netzhauterkrankung Studien.
Maus-Modellen dienen, Gendefekten zu identifizieren und molekularen Mechanismen, die Retinopathies6aufzuklären. OPN ist eine Form der Retinopathie mit erheblicher Schaden am Sehnerv (ON), die besteht aus ca. 1,2 Millionen RGC Axone. OPN kann kann fokussiert werden, den ein oder sekundär zu anderen Erkrankungen, angeborene oder nicht7, führt zum Verlust des Gesichtsfeldes und später, Blindheit. Wesenszüge der OPN sind RGC Verlust und Schaden, die beobachtet werden im menschlichen OAT als RNFL und GCL Verdünnung2,3. Unterdessen die Pathophysiologie der OPN ist immer noch schlecht verstanden, und daher die Notwendigkeit, Maus Netzhaut testen bleibt.
Dieses Manuskript beschreibt die Bildgebung und Quantifizierung der Netzhaut Schichtdicke, am Beispiel der Opa1DelTTAG Maus Linie8,9, ein Modell der dominanten Optikusatrophie (DOA)10. RGC Pathophysiologie zu bewerten, wurden radiale, rechteckig und ringförmigen Scans quantifiziert. Dies geschah entweder mit standard-Bremssättel der OCT-Software oder mit einem hausgemachten Makro für eine Open-Source Bildbearbeitungsprogramm entwickelt. Die standard-Bremssättel sind schwer zu manipulieren und oft dicker als die RNFL/GCL, während die hausgemachte Bremssättel einfach zu bedienen, reproduzierbare und präziser sind. Das Makro führt eine Messung für eine automatisch erkannten Schicht, in 5 Punkten und an einer festen Position auf beiden Seiten des ONH in der peripapillären Region. Das Ziel des vorliegenden Protokolls soll OCT Scan Erwerb dahingehend retinalen Positionierung, mit einem Fokus auf Routinggruppenconnectors zu beschreiben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das OCT-System, eine nicht-invasive in Vivo bildgebendes Verfahren, bietet hochauflösende Retina Langlauf-Absatz-wie Scans. So ist sein Hauptvorteil sein Potenzial für detaillierte Analyse, die wunderbare Möglichkeit, Protokolle, die routinemäßig angewendet auf den Menschen zu Mausmodellen umzusetzen.
Im Beispiel von Opa1DelTTAG mutierten Mäusen führt SD-OCT zeigten eine Zunahme der RNFL und GC komplexe Schichtdicke, die für die weitere Erforschung der DOA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Inserm, Université Montpellier, Netzhaut-Frankreich, Union nationale des Aveugles et Déficients konkretes (UNADEV), Verband-Syndrom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France und dem Laboratory of Excellence EpiGenMed Programm.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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