Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.
Abstract
Mudanças estruturais na retina são manifestações comuns de doenças oftálmicas. Tomografia de coerência óptica (OCT) permite a sua identificação no vivo— rapidamente, repetidamente e em alta resolução. Este protocolo descreve imagens OCT na retina do rato como uma poderosa ferramenta para estudar a neuropatia óptica (OPN). O sistema OCT é uma alternativa não-invasiva, baseada em interferometria para comuns ensaios post-mortem histológica. Ele fornece uma avaliação rápida e precisa da espessura da retina, permitindo a possibilidade de controlar alterações, tais como afinamento da retina ou espessamento. Apresentamos o processo e a análise de imagem com o exemplo da linha de rato Opa1delTTAG . Propõem-se três tipos de exames, com dois métodos de quantificação: pinças padrão e caseiras. O último é melhor para uso na retina peripapillary durante as varreduras radiais; sendo mais preciso, é preferível para a análise de estruturas mais finas. Todas as abordagens descritas aqui são projetadas para células ganglionares da retina (RGC), mas são facilmente adaptáveis para outras populações de células. Em conclusão, OCT é eficiente na fenotipagem de modelo de rato e tem potencial para ser usado para a avaliação confiável de intervenções terapêuticas.
Introduction
OCT é uma ferramenta de diagnóstico que facilita a análise das estruturas da retina1, incluindo a cabeça do nervo ótico (HNO). Ao longo dos anos tornou-se um indicador confiável de progressão da doença em seres humanos2,3, assim como em roedores4,5. Ele usa interferometria para criar imagens transversais das camadas da retina em uma resolução axial de 2 µm. A camada mais interna é a retina da fibra do nervo camada (RNFL), contendo axônios RGC, que é seguida pela camada de células ganglionares (GCL), contendo principalmente RGC corpos. Em seguida é a camada plexiforme interna (IPL), onde se encontram dendrites RGC axônios de células bipolares, horizontais e amacrine. Estes, juntamente com células horizontais, formam a camada nuclear interna (INL), e suas saliências conectar com axônios fotoreceptoras na camada plexiforme externa (OPL). Isto é seguido por camada nuclear externa (ONL), com corpos de células fotorreceptoras e é separado da camada fotoreceptoras pela membrana limitante externa (Proteus), também chamada segmento segmento interior/exterior (IS / OS) camada. Finalmente, as últimas camadas observáveis na retina do rato são o epithelium retinal do pigment (RPE) e a coroide (C). O RNFL sozinho normalmente é fino demais para ser medido em ratos; assim, analisar o GCL/RNFL em vez disso é preferível4,5. Outra possibilidade é a camada de complexo de GC, que contém o último além do IPL, tornando mais espesso e assim mesmo mais fácil medir na OCT verifica a4. Por conseguinte, OCT pode fornecer insights sobre o estado patológico da retina, tais como em OPNs.
Alternativamente, a espessura da retina do rato é frequentemente analisada com post-mortem de histologia. No entanto, esta técnica limitações de rostos relacionados com coleção de tecido, fixação, corte, coloração, montagem, etc. , portanto, alguns defeitos, tais como alterações de espessura sutil, não podem ser detectado. Finalmente, porque o mesmo mouse não pode ser testado no tempo vários pontos, o número de animais por estudar grandemente aumenta, ao contrário de TOC. Apesar de tudo, a não-invasividade, de alta resolução, possibilidade de repetição, monitoramento de tempo em tempo e facilidade de uso da tecnologia OCT fazem o método de escolha em estudos de doenças da retina.
Modelos de mouse são usados para identificar defeitos genéticos e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes retinopatias6. OPN é uma forma de retinopatia com substanciais danos ao nervo óptico (no), que é composta de aproximadamente 1,2 milhões axônios RGC. OPN pode ser focado em ON ou pode ser secundário a outros transtornos, inatos ou não7, levando à perda do campo visual e, mais tarde, cegueira. Traços característicos do OPN são perda RGC e no dano, que pode ser observado em OCT humana como RNFL e GCL desbaste2,3. Enquanto isso, a fisiopatologia do OPN é ainda mal compreendida, e, portanto, permanece a necessidade de testar as retinas do mouse.
Este manuscrito descreve a imagem e a quantificação da retina de espessura da camada, usando o exemplo do Opa1delTTAG rato linha8,9, um modelo de atrofia óptica dominante (DOA)10. Para avaliar a fisiopatologia RGC, radiais, anulares e retangulares exames foram quantificados. Isso foi feito com pinças padrão fornecidas pelo software OCT ou com uma macro caseira desenvolvido para um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto. Os compassos de calibre padrão são difíceis de manipular e muitas vezes mais espessa que a RNFL/GCL, enquanto os calipers caseiros são fáceis de usar, reprodutível e mais precisos. A macro executa uma medição para uma camada automaticamente detectada, em 5 pontos e em posições fixas, nos dois lados do HNO na região peripapillary. O objetivo do protocolo apresentado é descrever a aquisição de varredura OCT para especificar o posicionamento da retina, com foco em RGCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema OCT, um não-invasivo na vivo por imagens método, fornece scans de cross-section-como retina de alta resolução. Assim, sua principal vantagem é o seu potencial para análise detalhada, com a maravilhosa oportunidade de transpor protocolos rotineiramente aplicados aos seres humanos a modelos de rato.
No exemplo de Opa1delTTAG ratos mutantes, SD-OCT resultados mostraram um aumento de espessura de camada complexa de RNFL e GC, que permitiu maior explora?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Inserm, Université Montpellier, França de Retina, National Union des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Associação Síndrome de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France e o laboratório de excelência Programa de EpiGenMed.
Materials
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | – | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | – | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | – | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | – | – | Elastic band |
| Gauze pads 3"x3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | – | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | – | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0,9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | – | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | – | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
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