Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

Claudia A. Sim&#245;es-Pires; Vincent Zwick; Sylvian Cretton; Muriel Cuendet

doi:10.3791/55878

JoVE Journal > Chemistry

Chemistry

Samtidig måling av HDAC1 og HDAC6 aktivitet i HeLa celler ved hjelp av UHPLC-MS

Published: August 10, 2017

doi:

10.3791/55878

Claudia A. Simões-Pires*¹, Vincent Zwick*¹, Sylvian Cretton, Muriel Cuendet

¹Section des Sciences Pharmaceutiques,Universités des Geneva–Lausanne (EPGL)

Summary

Den nåværende metoden brukes til å identifisere isoformen-spesifikke hemmere av histone deacetylases (HDAC) i HeLa celler av UHPLC-MS analyse av flere underlag. Dette er et antistoff-fri metode utviklet for å gjenspeile HDAC1 og HDAC6 aktivitet i levende celle miljø, i motsetning til én-isoformen celle-fri analyser.

Abstract

Søk etter nye histone deacetylase (HDAC) hemmere er økende interesse i stoffet funnet. Isoformen selektivitet har vært i søkelyset siden godkjenning av romidepsin, en klasse jeg HDAC inhibitor for kreft terapi og kliniske undersøkelsen av HDAC6-spesifikke hemmere for myelom. Den nåværende metoden brukes til å bestemme hemmende aktiviteten til test forbindelser på HDAC1 og HDAC6 i cellene. Isoformen aktiviteten måles med ekstremt høy ytelse flytende kromatografi-massespektrometri (UHPLC-MS) analyse av bestemte underlag inkubert med behandlet og ubehandlet HeLa celler. Metoden har fordelen av reflekterer endogene HDAC aktiviteten i cellen miljøet, i motsetning til celle-fri biokjemiske analyser utført på isolerte isoformene. Videre, fordi den er basert på kvantifisering av syntetiske underlag, krever ikke metoden antistoff anerkjennelse av endogene acetylated proteiner. Det er lett tilpasses til flere linjer og en automatisert prosess. Metoden har allerede vist seg nyttig i å finne HDAC6-selektiv forbindelser i neuroblasts. Representant resultater er vist her med den standard HDAC hemmere trichostatin en (uspesifisert), MS275 (HDAC1-spesifikk), og tubastatin en (HDAC6-spesifikk) bruker HeLa celler.

Introduction

HDACs tilhører en familie av enzymer kunne deacetylate histones innen chromatin strukturen. De har andre protein underlag i stoffer og er plassert i ulike celle avdelinger. Totalt 18 HDAC isoformene funnet så langt og har vært knyttet til flere celle mekanismer, inkludert regulering av transkripsjonsfaktorer og genuttrykk, samt celle signalisering og transportere¹^,²^,,³^,,⁴^,,⁵^,,⁶^,,⁷. HDAC katalytisk hemmere har dukket opp som potensielle terapeutiske narkotika for kreft terapi. De fleste HDAC hemmere godkjent av FDA er for behandling av T-celle lymfom og myelom, og ikke-spesifikk HDAC hemmere, som vorinostat (SAHA), belinostat og panobinostat⁸^,⁹. Men en rekke bivirkninger er forbundet med pan-hemmere, og søk etter isoformen-spesifikke små molekyler er et hett tema i medisinsk kjemi og narkotika funnet. Følgelig klassen jeg (HDAC1-3 og HDAC8) selektiv hemmer romidepsin er en allerede godkjent narkotika¹⁰, mens HDAC6-spesifikke hemmere er for tiden under kliniske forsøk, med økt terapeutiske potensial i myelom¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵.

Screening analyser betegner HDAC er hemmere basert på inkubasjonstiden for en HDAC underlaget med en enzymatisk (enkelt isoformen, kjernefysiske ekstrakt eller celle lysate). Underlaget er vanligvis en liten peptid sekvens som inneholder en acetyl lysin rester koplet til en cleavable fluorophore (f.eks kumarin), som N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (MAL)¹⁶. Skille mellom isoformen-spesifikke aktiviteter, separat celle-fri analyser med hver isoformen er nødvendig og kan ikke gjenspeiler den virkelige isoformen aktiviteten i levende celler. Isoformen-spesifikke substratene er kommersielt tilgjengelige, for eksempel benzyl (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC, HDAC1 bestemt substrat) og (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic acid tert-butyl ester (BATCP, HDAC6 bestemt substrat) (figur 1B). Men vil en multi substrat blanding som inneholder MAL, MOCPAC og BATCP gitt til levende celler ikke tillate påvisning av de enkelte deacetylated produktene av fluorometric måling, gitt at de bærer den samme cleavable fluorophore.

Metoden beskrevet her kan av relativ kvantifisering av hver substrat og deacetylated produktet i HeLa celler ved hjelp av en multi substrat analysen etterfulgt av UHPLC-ESI–MS-/ MS analyse¹⁷. HDAC analysen er gjennomført på HeLa cellene direkte identifikasjonen av HDAC hemmende aktivitet og spesifisitet av testen forbindelser på endogene HDACs. Det er et fokus på HDAC1 og HDAC6, som vurderes samtidig. For å oppnå disse enzymatisk målingene i en enkelt inkubasjon analysen, lagt en blanding av ikke-spesifikk og spesifikke HDAC underlag til behandlet og ubehandlet HeLa celler belagt på en 96-brønns plate. Etter en inkubasjon trinn, er celler lysed for å løslate substrater og deres respektive reaksjon produkter, som er atskilt og oppdaget med en UHPLC-MULTIPLE Sclerosis metode (figur 1 c). Deacetylated produktene av underlagene. MAL, MOCPAC og BATCP er deacetylated MAL (dMAL), deacetylated MOCPAC (dMOCPAC) og deacetylated BATCP (dBATCP), henholdsvis. Dose-respons kurver kan bygges med aktive forbindelser.

Figur 1: generelle ordningen for cellen-basert HDAC analysen identifisere HDAC1 – og HDAC6-spesifikk hemmere av UHPLC-MS analyse av flere underlag. (A) ordningen med en typisk 96-brønns platen inneholder behandlet (test forbindelser) og ubehandlet (kontroll) HeLa celler, samt celle-ledig mellomrom. (B) kjemisk struktur av underlag lagt som en blanding (21 µM hver) til å være deacetylated av endogene HDACs. (C) typiske UHPLC-MS chromatogram viser fjelltoppene lagt substrater (MAL, MOCPAC og BATCP) og deres deacetylated produkter (dMAL, dMOCPAC, og dBACTP, henholdsvis). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. celle kultur Merk: Følgende er utført i en standard vev kultur hette. Fortrolighet med steril teknikk er forventet. Kultur HeLa celler til 80% confluency i en MT75 celle kultur kolbe i MEM supplert med 10% fosterets bovin serum, penicillin G (100 U/mL), og streptomycin (100 mg/mL).Merk: Celle kultur, behandling og lyse trinnene utføres under laminær strømning, med cellen inkubasjon trinn på 37 ° C utført i et fuktet 5% CO2 under sterile forhold. …

Representative Results

Å demonstrere bruk av metoden å identifisere ikke-selektive og selektiv hemmere for HDAC1 (klasse I) og HDAC6 (klasse IIb), HeLa celler ble behandlet med kjente standard forbindelser: trichostatin A (ikke-selektive mellom HDAC1 og HDAC6)18, MS275 (HDAC1-selektiv hemmer)19og tubastatin en (HDAC6-selektiv hemmer)20. Ved hjelp av metoden finnes (figur 1), IC50 verdier kan direkt…

Discussion

HDAC hemming er et hett tema i stoffet funnet, med gjeldende fokus på HDAC6-selektiv hemmere for kreft terapi²¹. HDAC selektivitet vurderes vanligvis av en rekke høy gjennomstrømning og celle-fri analyser, som akter å bestemme hemmende styrken mot individuelle HDAC isoformene²¹. Imidlertid selektivitet av en hemmer i tillegg bekreftes i levende celler ved å evaluere acetylation status endogene protein underlag, som histones (for klasse I HDACs) og tubulin (for HDAC6). …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne bekrefter pris handling CM1406 (Epigenetic kjemiske biologi). Forskningen i denne publikasjonen ble støttet av stiftelsen Pierre Mercier.

Materials

BATCP	Sigma-Aldrich	B4061
MAL	Sigma-Aldrich	SCP0168	Synonym: BOC-Ac-Lys-AMC
MOCPAC	Sigma-Aldrich	M2195
MS275	Sigma-Aldrich	EPS002
Trichostatin A	Sigma-Aldrich	T8552
Tubastatin A	Sigma-Aldrich	SML0044
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Scientific	10660131
Formic acid, LC/MS grade	Fisher Scientific	10596814
H₂O, HPLC grade			distilled H₂O filtered through a Milli-Q purification system
HeLa cells	ATCC	ATCC CRM-CCL-2
Cell dissociation reagent TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013
DMSO, cell culture grade	Applichem	146463
DPBS	ThermoFisher Scientific	14190144
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
MEM	ThermoFisher Scientific	22561021
Penicillin-Streptomycin	Bioconcept	4-01F00-H
10X RIPA buffer	Abcam	ab156034
SigmaFast protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	S8820
96-well plates, sterile, flat-bottom, tissue culture treated Corning	VWR	29442-058
96-well plates, non-sterile, V-bottom Corning	VWR	29442-404	used in the centrifugation step
96-well plate, conical bottom, Nunc	ThermoFisher Scientific	249944	compatible with the Acquity UHPLC system
T75 cell culture flasks Corning	Sigma-Aldrich	CLS430641
Peelable heat sealing foil	Waters	186002789
Acquity UPLC system	Waters
Eppendorf Centrifuge 5810 R	Fisher Scientific	05-413-323
Integration software: MassLynx V4.1	Waters		Catalog number not available
Combi thermo-sealer SP-0669/240	Waters		Catalog number not available
Quattro micro API Tandem Quadrupole System	Waters		Catalog number not available

References

Arrowsmith, C. H., Bountra, C., Fish, P. V., Lee, K., Schapira, M. Epigenetic protein families: a new frontier for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 11 (5), 384-400 (2012).
Henikoff, S., Greally, J. M. Epigenetics, cellular memory and gene regulation. Curr Biol. 26 (14), R644-R648 (2016).
Kim, C., et al. HDAC6 inhibitor blocks amyloid beta-induced impairment of mitochondrial transport in hippocampal neurons. PLoS One. 7 (8), (2012).
Kawaguchi, Y., et al. The deacetylase HDAC6 regulates aggresome formation and cell viability in response to misfolded protein stress. Cell. 115 (6), 727-738 (2003).
Zhao, Y., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol. 26 (7), 2782-2790 (2006).
Berger, S. L. Histone modifications in transcriptional regulation. Curr Opin Genet Dev. 12 (2), 142-148 (2002).
Simões-Pires, C., et al. HDAC6 as a target for neurodegenerative diseases: what makes it different from the other HDACs?. Mol Neurodegener. 8 (7), 1-16 (2013).
Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone deacetylase inhibitors in clinical studies as templates for new anticancer agents. Molecules. 20 (3), 3898-3941 (2015).
Manal, M., Chandrasekar, M. J., Gomathi Priya, J., Nanjan, M. J. Inhibitors of histone deacetylase as antitumor agents: A critical review. Bioorg Chem. 67, 18-42 (2016).
Mack, G. S. To selectivity and beyond. Nat Biotech. 28 (12), 1259-1266 (2010).
. Study of ACY-1215 alone and in combination with bortezomib and dexamethasone in multiple myeloma (ACY-1215) Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01323751 (1211)
. Study of ACY-1215 in combination with lenalidomide, and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01583283 (2012)
. 13ACY-1215 (ricolinostat) in combination with pomalidomide and low-dose dex in relapsed-and-refractory multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01997840 (2013)
. Study of ACY-241 alone and in combination with pomalidomide and dexamethasone in multiple myeloma Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02400242 (2015)
Yee, A. J., et al. Ricolinostat plus lenalidomide, and dexamethasone in relapsed or refractory multiple myeloma: a multicentre phase 1b trial. Lancet Oncol. 17 (11), 1569-1578 (2016).
Jung, M. Homogenous non-isotopic assays for histone deacetylase activity. Expert Opin Ther Pat. 13 (6), 935 (2003).
Zwick, V., Simões-Pires, C., Cuendet, M. Cell-based multi-substrate assay coupled to UHPLC-ESI-MS/MS for a quick identification of class-specific HDAC inhibitors. J Enzyme Inhibi Med Chem. 31 (1), 209-214 (2016).
Khan, N., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J. 409 (2), 581-589 (2008).
Glaser, K. B., et al. Differential protein acetylation induced by novel histone deacetylase inhibitors. Biochem Biophys Res Commun. 325 (3), 683-690 (2004).
Butler, K. V., et al. Rational design and simple chemistry yield a superior, neuroprotective HDAC6 inhibitor, tubastatin A. J Am Chem Soc. 132 (31), 10842-10846 (2010).
Jung, M., Yong, K. -. J., Velena, A., Lee, S., Sippl, W., Jung, M. Cell-Based Assays for HDAC Inhibitor Hit Validation. Epigenetic Targets in Drug Discovery. , (2010).
Milli, A., et al. Proteomic analysis of cellular response to novel proapoptotic agents related to atypical retinoids in human IGROV-1 ovarian carcinoma cells. J Proteome Res. 10 (3), 1191-1207 (2011).
Zwick, V., et al. Synthesis of a selective HDAC6 inhibitor active in neuroblasts. Bioorg Med Chem Lett. 26 (20), 4955-4959 (2016).
Ciossek, T., Julius, H., Wieland, H., Maier, T., Beckers, T. A homogeneous cellular histone deacetylase assay suitable for compound profiling and robotic screening. Anal Biochem. 372 (1), 72-81 (2008).
Heltweg, B., Dequiedt, F., Marshall, B. L., Brauch, C., Yoshida, M., et al. Subtype selective substrates for histone deacetylases. J Med Chem. 47 (21), 5235-5243 (2004).
Copeland, R. A. . Evaluation of enzyme inhibitors in drug discovery. , (2005).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Simões-Pires, C. A., Zwick, V., Cretton, S., Cuendet, M. Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS. J. Vis. Exp. (126), e55878, doi:10.3791/55878 (2017).