الاستقراء والتشخيص للأورام في<em> ذبابة الفاكهة</em> إيماجينال القرص إبيثيليا
Summary
تحليل استنساخ الفسيفساء في ذبابة الفاكهة تخيلي القرص ظهارة هو نظام نموذج قوي لدراسة الآليات الوراثية والخلوية من تكون الأورام. نحن هنا وصف بروتوكول للحث على الأورام في أقراص ذبابة الجناح ذبابة الفاكهة باستخدام نظام GAL4-واس، وإدخال طريقة التشخيص لتصنيف المظاهر الورمية.
Abstract
في المراحل المبكرة من السرطان، والخلايا المتحولة تتحول تظهر تشوهات الخلوية، وتبدأ فرط غير المنضبط، وتعطيل تدريجيا تنظيم الأنسجة. وقد ظهرت ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر كنظام نموذج تجريبي شعبية في علم الأحياء السرطان لدراسة الآليات الوراثية والخلوية لتوليد الأورام. على وجه الخصوص، وأدوات وراثية للأقراص تمايل ذبابة الفاكهة (تطوير الظهارة في اليرقات) تمكن من إنشاء خلايا الموالية للورم تتحول داخل الأنسجة الظهارية العادية، وهو وضع مماثل للمراحل الأولية لسرطان الإنسان. وأظهرت دراسة حديثة عن تكوين الأورام في أقراص تخيل الجناح ذبابة الفاكهة ، أن بدء الورم يعتمد على الهندسة المعمارية الخلوية الأنسجة الداخلية والمكروية المحلية، مما يشير إلى أنه من المهم النظر في قابلية المنطقة محددة لمؤثرات الأورام في تقييم المظاهر الورمية في خيال أقراص. لتسهيل التحليل المظهري من التقدم الورمعلى أقراص تخيلي، هنا نحن تصف بروتوكول للتجارب الوراثية باستخدام نظام GAL4-واس للحث على الأورام الورم في أقراص تخيل الجناح. نحن أيضا إدخال طريقة التشخيص لتصنيف المظاهر من الآفات النسلي الناجم عن ظهارة ظهارية، كما لم يتم وصفها طريقة تصنيف واضحة للتمييز في مراحل مختلفة من تطور الورم (مثل تضخم، خلل التنسج، أو الورم) من قبل. قد تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق على نطاق واسع على تحليل نسيلي من المظاهر الورمية في مختلف الأجهزة في ذبابة الفاكهة .
Introduction
الأنسجة الظهارية هي نظم منظمة للغاية التي لديها القدرة هوموستاتيك ملحوظ للحفاظ على تنظيمها من خلال التنمية ودوران الخلية. هذا النظام الذاتي التنظيم القوي، ومع ذلك، تتعطل تدريجيا خلال تطور الورم. في بداية تطور الورم، والخلايا الطافرة الفردية الناشئة عن تفعيل الجين الورم أو ورم-قمع تعطيل الجينات تظهر داخل طبقة الظهارية. عندما يتحول هذا "الخلية المؤيدة للورم" يتلاشى بيئة قمعية، ويعطل تنظيم الظهارية، ويبدأ انتشار غير المنضبط، يحدث الأورام 1 . خلال العقود القليلة الماضية، أحرز التقدم التكنولوجي المتميز في علم الوراثة والبيولوجيا الجزيئية تقدما ملحوظا في أبحاث السرطان. على وجه الخصوص، والدراسات الحديثة باستخدام أدوات تحليل الفسيفساء وراثيا في ميلانوغاستير ذبابة الفاكهة ، مثل فلب-فرت (فليباس ريكومبيناس / فليباس ريكومبيناس الهدف) ريكومبين الإنقساميةأتيون 2 والوجه خارج GAL4-واس (تسلسل تفعيل المنبع) 3 ، ساهمت إلى حد كبير في فهم أفضل للآليات الوراثية المشاركة في تشكيل ورم خبيث من الأورام 4 و 5 و 6 .
دراسات لمجموعة من الجينات السرطانية، القامع الحفظ ذبابة الفاكهة، اليرقات العملاقة القاتلة (LGL)، وأقراص كبيرة (أجهزة …)، وخربشات (scrib)، سلط الضوء على العلاقة الحاسمة بين فقدان التنظيم الظهارية والتنمية الورم، حيث أن هذه الجينات تلعب أدوارا رئيسية في تنظيم قطبية الخلايا القاعدية وانتشار الخلايا في الأنسجة الظهارية 7 . في حين أن ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي هي عادة ظهارة أحادي الطبقة، والطفرات متماثلة في أي من هذه الجينات الثلاثة تسبب الخلايا لانقاص هيكل وقطعية، تفشل في ديفريفيات، أوفيربروليفيرات، وتشكل في نهاية المطاف الجماهير غير متبلور متعدد الطبقات التي فتيل مع الأنسجة المجاورة 7 . وبالمثل، انقطاع هذه الجينات في الثدييات وتشارك في تطوير الأورام الخبيثة 8 ، 9 . وقد أدت الأنماط الظاهرية للأورام التي عرضتها الأنسجة المتحولة إلى تصنيف هذه الجينات الثلاثة كجينات مضادة للورم الورمية (نتسغس) 7 ، 8 . ومع ذلك، عندما يتم إنشاء خلايا متحولة نتس متماثل متماثل في تطوير البرية نوع أقراص تخيل باستخدام فلب-فرت بوساطة إعادة التركيب الانقسامية، والقضاء على الخلايا الطافرة من الأنسجة من خلال C- جون كيناز محطة N- (جنك) موت الخلايا المبرمج 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، إكستروسيون 15 </sup> ، 16 ، أو غمر و البلعمة من قبل الجيران 17 . في هذه الظهارة الفسيفساء وراثيا، وكشف معظم موت الخلايا المبرمج في الخلايا متحولة نتس تقع على حدود استنساخ، مما يشير إلى أن الخلايا الطبيعية المجاورة تؤدي موت الخلايا المبرمج للخلايا متحولة نتس 10 ، 11 ، 12 ، 18 . وقد أكدت الدراسات الحديثة في خلايا الثدييات أن هذه الخلية تعتمد على المنافسة القضاء على الخلايا المؤيدة للورم هو آلية الحفاظ على الظهارية دفاعيا التطورية ضد السرطان 19 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 .
ومع ذلك، أظهرت دراسة حديثة في أقراص ترويض ذبابة الفاكهة أن فسيفساء نتس-نوكدون استنساخ يدفع الأورام الورم في سبيسيفالمناطق جيم من أقراص تخيل الجناح 16 . تم العثور على تشكيل الورم الأولي دائما في المنطقة "المفصلي" الطرفية ولم يلاحظ قط في المنطقة "الحقيبة" المركزية من ظهارة القرص الجناح، مما يشير إلى أن إمكانات المستضد للخلايا نتس ضربة قاضية يعتمد على البيئة المحلية. تعمل منطقة الحقيبة المركزية على أنها "نقطة باردة للورم" حيث الخلايا المؤيدة للورم لا تظهر فرط التنسج الخاطئ، في حين أن منطقة المفصلي الطرفية تتصرف باعتبارها "نقطة ساخنة للورم" 16 . في مناطق "البرد" الحقيبة، خلايا نتس-ضربة قاضية ديلامينات من الجانب القاعدي وتخضع موت الخلايا المبرمج. على النقيض من ذلك، كما خلايا "المفصلي" المفصلي تمتلك شبكة من الهياكل الهيكلية قوية على الجانبين القاعدية، وخلايا نتس-ضربة قاضية ديلامينات من الجانب القمي من ظهارة والشروع في فرط نمو الأورام 16 . لذلك، تحليل الظواهر الورم في أقراص تخيلي يتطلب كونسي حذرادييراتيون من حساسية المنطقة محددة لمؤثرات الأورام.
هنا، نحن تصف بروتوكول للحث على تشكيل الورم الأورام في الجناح ذبابة الفاكهة أقراص تخيلي باستخدام نظام رني GAL4-UAS- التي يتم إنشاؤها خلايا ضربة قاضية nTSG في العادية القرص الجناح ظهائر. على الرغم من أن هذه النظم التجريبية مفيدة لدراسة المراحل المبكرة من السرطان، لم يتم وصف طريقة تصنيف واضحة لتقييم مراحل تطور الورم في ظهارة القرص ظاهري من قبل. لذلك، فإننا نقترح أيضا طريقة تشخيص لتصنيف الظواهر النسلية المؤيدة للورم التي يسببها ظهارة القرص الجناح إلى ثلاث فئات: تضخم (عدد كبير من الخلايا التي تظهر بشكل طبيعي مع زيادة الانتشار)، خلل التنسج (الأنسجة سابقة التأليف تتألف من ظهور غير طبيعي الخلايا)، والأورام (ورم حميدة أو خبيثة تتألف من خلايا لها مظهر غير طبيعي ونمط انتشار غير طبيعي).
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام GAL4-واس هي واحدة من الأدوات الوراثية أقوى للتعبير الجيني المستهدفة في ذبابة الفاكهة 26 ويسهل إلى حد كبير تحريض الخلايا السرطانية والتحليل في الجسم الحي 4 . هذا النظام يتيح توليد الحيوانات المستنسخة التي تحمل ضربة قاضية من الجين?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر J. فوغن للقراءة النقدية للمخطوطة. وأيد هذا العمل من المنح من جسبس كاكينهي أرقام المنحة 26891025، 15H01500 ومنحة البحوث مؤسسة تاكيدا العلوم إلى يت
Materials
| Reagents | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
| TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
| Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| normal goat serum | Sigma | G6767 | |
| mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
| mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
| goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly strains | |||
| sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
| upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
| UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
| UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
| UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
| hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
| Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
| UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
| UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
| vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Struhl, G., Basler, K. Organizing activity of wingless protein in Drosophila. Cell. 72 (4), 527-540 (1993).
- Potter, C. J., Turenchalk, G. S., Xu, T. Drosophila in cancer research. An expanding role. Trends Genet. 16 (1), 33-39 (2000).
- Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4 (6), 753-761 (2011).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2013).
- Bilder, D. Epithelial polarity and proliferation control: links from the Drosophila neoplastic tumor suppressors. Genes Dev. 18 (16), 1909-1925 (2004).
- Humbert, P. O., et al. Control of tumourigenesis by the Scribble/Dlg/Lgl polarity module. Oncogene. 27 (55), 6888-6907 (2008).
- Huang, L., Muthuswamy, S. K. Polarity protein alterations in carcinoma: a focus on emerging roles for polarity regulators. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 41-50 (2010).
- Brumby, A. M., Richardson, H. E. scribble mutants cooperate with oncogenic Ras or Notch to cause neoplastic overgrowth in Drosophila. EMBO J. 22 (21), 5769-5779 (2003).
- Igaki, T., Pastor-Pareja, J. C., Aonuma, H., Miura, M., Xu, T. Intrinsic tumor suppression and epithelial maintenance by endocytic activation of Eiger/TNF signaling in Drosophila. Dev Cell. 16 (3), 458-465 (2009).
- Tamori, Y., et al. Involvement of Lgl and Mahjong/VprBP in cell competition. PLoS Biol. 8 (7), e1000422 (2010).
- Cordero, J. B., et al. Oncogenic Ras diverts a host TNF tumor suppressor activity into tumor promoter. Dev Cell. 18 (6), 999-1011 (2010).
- Yamamoto, M., Ohsawa, S., Kunimasa, K., Igaki, T. The ligand Sas and its receptor PTP10D drive tumour-suppressive cell competition. Nature. 542 (7640), 246-250 (2017).
- Vaughen, J., Igaki, T. Slit-Robo Repulsive Signaling Extrudes Tumorigenic Cells from Epithelia. Dev Cell. 39 (6), 683-695 (2016).
- Tamori, Y., Suzuki, E., Deng, W. -. M. Epithelial Tumors Originate in Tumor Hotspots, a Tissue-Intrinsic Microenvironment. PLoS Biol. 14 (9), e1002537 (2016).
- Ohsawa, S., et al. Elimination of oncogenic neighbors by JNK-mediated engulfment in Drosophila. Dev Cell. 20 (3), 315-328 (2011).
- Menéndez, J., Pérez-Garijo, A., Calleja, M., Morata, G. A tumor-suppressing mechanism in Drosophila involving cell competition and the Hippo pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14651-14656 (2010).
- Hogan, C., et al. Characterization of the interface between normal and transformed epithelial cells. Nat Cell Biol. 11 (4), 460-467 (2009).
- Kajita, M., et al. Interaction with surrounding normal epithelial cells influences signalling pathways and behaviour of Src-transformed cells. J Cell Sci. 123 (Pt 2), 171-180 (2010).
- Norman, M., et al. Loss of Scribble causes cell competition in mammalian cells. J Cell Sci. 125 (1), 59-66 (2012).
- Wagstaff, L., et al. Mechanical cell competition kills cells via induction of lethal p53 levels. Nat Commun. 7, 1-14 (2016).
- Kajita, M., Fujita, Y. EDAC: Epithelial defence against cancer-cell competition between normal and transformed epithelial cells in mammals. J Biochem. 158 (1), 15-23 (2015).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Jory, A., et al. A survey of 6,300 genomic fragments for cis-regulatory activity in the imaginal discs of Drosophila melanogaster. Cell Rep. 2 (4), 1014-1024 (2012).
- McGuire, S. E., Le, P. T., Osborn, A. J., Matsumoto, K., Davis, R. L. Spatiotemporal rescue of memory dysfunction in Drosophila. Science. 302 (5651), 1765-1768 (2003).
- Rodrigues, A. B., et al. Activated STAT regulates growth and induces competitive interactions independently of Myc, Yorkie, Wingless and ribosome biogenesis. Development. 139 (21), 4051-4061 (2012).
- Khan, S. J., et al. Epithelial neoplasia in Drosophila entails switch to primitive cell states. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), E2163-E2172 (2013).
- Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302 (5648), 1227-1231 (2003).
- Gonzalez, C. Drosophila melanogaster: a model and a tool to investigate malignancy and identify new therapeutics. Nat Rev Cancer. 13 (3), 172-183 (2013).
- Patel, P. H., Edgar, B. A. Tissue design: how Drosophila tumors remodel their neighborhood. Semin Cell Dev Biol. 28, 86-95 (2014).
- Nakajima, Y. -. I., Meyer, E. J., Kroesen, A., McKinney, S. A., Gibson, M. C. Epithelial junctions maintain tissue architecture by directing planar spindle orientation. Nature. 500 (7462), 359-362 (2013).
- Colombani, J., Andersen, D. S., Léopold, P. Secreted peptide Dilp8 coordinates Drosophila tissue growth with developmental timing. Science. 336 (6081), 582-585 (2012).
- Garelli, A., Gontijo, A. M., Miguela, V., Caparros, E., Dominguez, M. Imaginal discs secrete insulin-like peptide 8 to mediate plasticity of growth and maturation. Science. 336 (6081), 579-582 (2012).
